Bestrijding van de diagnostische impasse bij mitochondriale ziekten: een transcriptomische benadering van fibroblasten en bloedcellen (RNAseq)

Sequencing van de volgende generatie (NGS), en in het bijzonder hele exome sequencing (WES) of genoomsequencing (WGS), heeft een aanzienlijke technische vooruitgang mogelijk gemaakt die de genetische diagnostiek aanzienlijk heeft verbeterd. Ongeveer 50% van de patiënten is echter nog steeds niet gediagnosticeerd en verkeert in een diagnostische onzekerheid. Eén van de oorzaken hiervan zijn pathogene varianten die de transcriptexpressie en/of RNA-splitsing wijzigen. Deze varianten kunnen zich bevinden in diepe intronische of intergene gebieden, of in de coderende sequentie, synonieme of missense varianten, die ook pathogene gevolgen hebben voor de splitsing of genexpressie. Het is heel vaak moeilijk om de pathogeniteit van deze varianten te interpreteren, omdat het vaak varianten van onzekere betekenis (VSI) blijven. Het nut van transcriptoomsequencing (RNA-seq) bij de genetische diagnose van MM is de afgelopen jaren aangetoond door verschillende teams met diagnostische opbrengsten van 10% tot 35% (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Deze onderzoeken worden idealiter uitgevoerd met behulp van spierweefsel, omdat MM’s het vaakst tot expressie komen in weefsels met een hoog energiemetabolisme, zoals spieren, hart, hersenen of lever (Cummings et al. 2017). Omdat biopsieën van deze weefsels echter moeilijk te verkrijgen zijn, worden de meeste transcriptstudies uitgevoerd met fibroblasten verkregen uit huidbiopten (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Extreme regulatiedefecten zoals verlies van expressie of afwijkende splitsing kunnen inderdaad worden gedetecteerd in fibroblasten, ook al zijn de fysiologische gevolgen voor fibroblasten mogelijk verwaarloosbaar. Sommige patiënten weigeren echter ook deze biopsieën en kunnen in het diagnostische ongewisse blijven bij gebrek aan functionele analyse om de pathogeniteit van de geïdentificeerde varianten te bevestigen. RNA-onderzoeken kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van RNA dat is geëxtraheerd uit bloedcellen op PAXGene-buisjes (Frésard et al, 2019). De hoeveelheid geëxtraheerd RNA is lager dan die geëxtraheerd uit fibroblasten, maar dit type analyse (i) vermijdt een meer invasieve procedure, (ii) bespaart technische tijd door de manipulaties te vermijden die gepaard gaan met celcultuur, en (iii) bespaart tijd voor de patiënt door onmiddellijke extractie uit de bloedbuis mogelijk te maken zonder te wachten op celcultuur. Frésard et al. toonden bij patiënten met 16 verschillende Mendeliaanse pathologieën aan dat RNA-seq op bloedcellen een diagnose identificeerde bij 7,5% van de geteste patiënten (Frésard et al, 2019). Hun aanpak bracht zowel expressievariaties als splitsingsafwijkingen aan het licht.

Wij stellen daarom voor om een ​​transcriptstudie uit te voeren met gebruikmaking van high-throughput RNA-sequencing (RNA-Seq), parallel op RNA geëxtraheerd uit fibroblasten en op RNA geëxtraheerd uit bloedcellen, bij 10 patiënten met vermoedelijke mitochondriale ziekte bij wie varianten van onzekere betekenis in het bloed voorkomen. kandidaatgenen (VSI+) zijn geïdentificeerd.

We kozen ervoor om ons onderzoek te richten op patiënten met VSI+, eerder geïdentificeerd door NGS, om de interpretatie van de RNA-Seq-gegevens te vergemakkelijken in het kader van een 'pilot'-onderzoek. Bij deze patiënten, die varianten in kandidaatgenen dragen, zullen we onze bio-informatica-analyse op deze genen concentreren. Voor de interpretatie van VSI+ is een gerichte aanpak met behulp van Sanger-sequencing op basis van RT-PCR, of kwantificering van genexpressie met behulp van kwantitatieve PCR, ook haalbaar, maar vereist maatwerk per variant, wat zeer tijdrovend en niet onbelangrijk duur is. Het voordeel van een RNA-seq-benadering is dat deze de diagnostische strategie voor patiënten homogeniseert, analysetijd bespaart en daardoor de tijd die wordt besteed aan diagnostische dwalingen vermindert. Ten slotte betekent de drastische verlaging van de kosten van NGS-sequencing dat deze techniek routinematig kan worden gebruikt als aanvulling op exoom-/genoomsequencing. Het zou daarom uiteindelijk niet alleen kunnen worden toegepast op patiënten met VSI+, maar ook, bij gebrek aan bewijs van potentieel pathogene varianten, als hulpmiddel bij het filteren van door WES/WGS geïdentificeerde varianten.