Bekæmpelse af det diagnostiske dødvande i mitokondrielle sygdomme: en transkriptomisk tilgang i fibroblaster og blodceller (RNAseq)

Næste generations sekventering (NGS), og især hele exome sekventering (WES) eller genom sekventering (WGS), har muliggjort et betydeligt teknisk fremskridt, der har forbedret genetisk diagnostik betydeligt. Imidlertid forbliver omkring 50 % af patienterne stadig udiagnosticerede og er i diagnostisk limbo. En af årsagerne til dette er patogene varianter, der modificerer transkriptekspression og/eller RNA-splejsning. Disse varianter kan være lokaliseret i dybe introniske eller intergene regioner eller i den kodende sekvens, synonyme eller missense-varianter, hvilket også har patogene konsekvenser for splejsning eller genekspression. Det er meget ofte svært at fortolke patogeniciteten af ​​disse varianter, som ofte forbliver varianter af usikker betydning (VSI). Nytten af ​​transkriptom-sekventering (RNA-seq) i den genetiske diagnose af MM er blevet påvist i de senere år af adskillige teams med diagnostiske udbytter på 10 % til 35 % (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Disse undersøgelser udføres ideelt set ved brug af muskelvæv, da MM'er oftest kommer til udtryk i væv med højt energistofskifte såsom muskel, hjerte, hjerne eller lever (Cummings et al. 2017). Men da biopsier af disse væv er vanskelige at opnå, udføres de fleste transkriptionsundersøgelser ved hjælp af fibroblaster opnået fra hudbiopsier (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Faktisk kan ekstreme regulatoriske defekter såsom tab af udtryk eller afvigende splejsning påvises i fibroblaster, selvom den fysiologiske konsekvens på fibroblaster kan være ubetydelig. Nogle patienter afviser dog også disse biopsier og kan forblive i diagnostisk limbo i fravær af funktionel analyse for at bekræfte patogeniciteten af ​​de identificerede varianter. RNA-undersøgelser kan også udføres ved hjælp af RNA ekstraheret fra blodceller på PAXGene-rør (Frésard et al, 2019). Mængden af ​​ekstraheret RNA er lavere end den, der ekstraheres fra fibroblaster, men denne type analyse (i) undgår en mere invasiv procedure, (ii) sparer teknisk tid ved at undgå maniperne forbundet med cellekultur, og (iii) sparer tid for patient ved at muliggøre øjeblikkelig ekstraktion fra blodrøret uden at vente på cellekultur. Frésard et al viste hos patienter med 16 forskellige Mendelske patologier, at RNA-seq på blodceller identificerede en diagnose hos 7,5 % af de testede patienter (Frésard et al, 2019). Deres tilgang afslørede både udtryksvariationer og splejsningsanomalier.

Vi foreslår derfor at udføre et transkriptionsstudie med high-throughput RNA-sekventering (RNA-Seq), parallelt på RNA ekstraheret fra fibroblaster og på RNA ekstraheret fra blodceller på 10 patienter med mistanke om mitokondriel sygdom, hos hvem varianter af usikker betydning i kandidatgener (VSI+) er blevet identificeret.

Vi valgte at målrette vores undersøgelse på patienter med VSI+, tidligere identificeret af NGS, for at lette fortolkningen af ​​RNA-Seq-dataene inden for rammerne af et "pilot"-studie. Hos disse patienter, som bærer varianter i kandidatgener, vil vi fokusere vores bioinformatiske analyse på disse gener. Til fortolkningen af ​​VSI+ er en målrettet tilgang ved hjælp af Sanger-sekventering baseret på RT-PCR, eller kvantificering af genekspression ved hjælp af kvantitativ PCR, også mulig, men kræver tilpasset udvikling for hver variant, hvilket er meget tidskrævende og ikke uvæsentligt dyrt. Fordelen ved en RNA-seq tilgang er, at den homogeniserer den diagnostiske strategi for patienter, sparer analysetid og derfor reducerer den tid, der bruges på diagnostisk vandring. Endelig betyder den drastiske reduktion i omkostningerne ved NGS-sekventering, at denne teknik kunne bruges rutinemæssigt som et supplement til exom/genom-sekventering. Det kunne derfor i sidste ende anvendes ikke kun på patienter med VSI+, men også, i mangel af bevis for potentielt patogene varianter, som en hjælp til filtrering af varianter identificeret af WES/WGS.