Борьба с диагностическим тупиком при митохондриальных заболеваниях: транскриптомный подход к фибробластам и клеткам крови (RNAseq)

Секвенирование следующего поколения (NGS), и в частности секвенирование всего экзома (WES) или секвенирование генома (WGS), позволило добиться значительного технического прогресса, который значительно улучшил генетическую диагностику. Однако около 50% пациентов до сих пор не диагностированы и находятся в диагностическом подвешенном состоянии. Одной из причин этого являются патогенные варианты, которые модифицируют экспрессию транскриптов и/или сплайсинг РНК. Эти варианты могут располагаться в глубоких интронных или межгенных областях или в кодирующей последовательности, являться синонимичными или миссенс-вариантами, также оказывающими патогенное воздействие на сплайсинг или экспрессию генов. Очень часто бывает сложно интерпретировать патогенность этих вариантов, которые часто остаются вариантами неопределенного значения (ВСИ). Полезность секвенирования транскриптома (RNA-seq) для генетической диагностики ММ была продемонстрирована в последние годы несколькими группами с диагностической эффективностью от 10% до 35% (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Эти исследования в идеале проводятся с использованием мышечной ткани, поскольку ММ чаще всего экспрессируются в тканях с высоким энергетическим метаболизмом, таких как мышцы, сердце, мозг или печень (Каммингс и др., 2017). Однако, поскольку биопсию этих тканей получить трудно, большинство исследований транскриптов проводят с использованием фибробластов, полученных из биопсии кожи (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Действительно, в фибробластах могут быть обнаружены крайние регуляторные дефекты, такие как потеря экспрессии или аберрантный сплайсинг, хотя физиологические последствия для фибробластов могут быть незначительными. Однако некоторые пациенты также отказываются от этих биопсий и могут оставаться в диагностической неопределенности из-за отсутствия функционального анализа для подтверждения патогенности выявленных вариантов. Исследования РНК также можно проводить с использованием РНК, выделенной из клеток крови в пробирках PAXGene (Frésard et al, 2019). Количество экстрагированной РНК ниже, чем экстрагированное из фибробластов, но этот тип анализа (i) позволяет избежать более инвазивной процедуры, (ii) экономит техническое время, избегая манипуляций, связанных с культурой клеток, и (iii) экономит время для пациента, позволяя немедленно извлечь кровь из пробирки, не дожидаясь клеточной культуры. Фресар и др. показали у пациентов с 16 различными менделевскими патологиями, что секвенирование РНК на клетках крови позволило выявить диагноз у 7,5% обследованных пациентов (Frésard et al, 2019). Их подход выявил как вариации экспрессии, так и аномалии сплайсинга.

Поэтому мы предлагаем провести исследование транскриптов с использованием высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-Seq) параллельно на РНК, экстрагированной из фибробластов, и на РНК, экстрагированной из клеток крови, у 10 пациентов с подозрением на митохондриальное заболевание, у которых имеются варианты неопределенной значимости в гены-кандидаты (VSI+) были идентифицированы.

Мы решили нацелить наше исследование на пациентов с VSI+, ранее выявленным NGS, чтобы облегчить интерпретацию данных RNA-Seq в рамках «пилотного» исследования. У этих пациентов, несущих варианты генов-кандидатов, мы сосредоточим наш биоинформатический анализ на этих генах. Для интерпретации VSI+ также возможен целевой подход с использованием секвенирования по Сэнгеру на основе RT-PCR или количественного определения экспрессии генов с использованием количественной ПЦР, но требует индивидуальной разработки для каждого варианта, что требует очень много времени и немало затрат. Преимущество подхода РНК-секвенирования заключается в том, что он унифицирует диагностическую стратегию для пациентов, экономит время анализа и, следовательно, сокращает время, затрачиваемое на диагностические блуждания. Наконец, резкое снижение стоимости секвенирования NGS означает, что этот метод можно регулярно использовать в качестве дополнения к секвенированию экзома/генома. Таким образом, в конечном итоге его можно будет применять не только к пациентам с VSI+, но также, при отсутствии доказательств потенциально патогенных вариантов, в качестве вспомогательного средства для фильтрации вариантов, идентифицированных с помощью WES/WGS.