Boj proti diagnostické slepé uličce u mitochondriálních onemocnění: transkriptomický přístup ve fibroblastech a krevních buňkách (RNAseq)

Sekvenování nové generace (NGS), a zejména sekvenování celého exomu (WES) nebo sekvenování genomu (WGS), umožnilo významný technický pokrok, který výrazně zlepšil genetickou diagnostiku. Přibližně 50 % pacientů však stále zůstává nediagnostikováno a nachází se v diagnostickém limbu. Jednou z příčin jsou patogenní varianty, které modifikují expresi transkriptu a/nebo sestřih RNA. Tyto varianty mohou být umístěny v hlubokých intronových nebo intergenových oblastech nebo v kódující sekvenci, synonymních nebo chybných variantách, které mají také patogenní důsledky na sestřih nebo genovou expresi. Velmi často je obtížné interpretovat patogenitu těchto variant, které často zůstávají variantami nejistého významu (VSI). Užitečnost sekvenování transkriptomů (RNA-seq) v genetické diagnostice MM prokázalo v posledních letech několik týmů s diagnostickou výtěžností 10 % až 35 % (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Tyto studie se ideálně provádějí pomocí svalové tkáně, protože MM jsou nejčastěji exprimovány ve tkáních s vysokým energetickým metabolismem, jako jsou svaly, srdce, mozek nebo játra (Cummings et al. 2017). Protože je však obtížné získat biopsie těchto tkání, většina transkriptových studií se provádí pomocí fibroblastů získaných z kožních biopsií (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Ve fibroblastech lze skutečně detekovat extrémní regulační defekty, jako je ztráta exprese nebo aberantní sestřih, i když fyziologický následek na fibroblasty může být zanedbatelný. Někteří pacienti však také odmítají tyto biopsie a mohou zůstat v diagnostickém limbu bez funkční analýzy k potvrzení patogenity identifikovaných variant. Studie RNA lze také provádět pomocí RNA extrahované z krevních buněk na zkumavkách PAXGene (Frésard et al, 2019). Množství extrahované RNA je nižší než množství extrahované z fibroblastů, ale tento typ analýzy (i) se vyhýbá invazivnějšímu postupu, (ii) šetří technický čas tím, že se vyhne manipulacím spojeným s buněčnou kulturou, a (iii) šetří čas pacienta tím, že umožňuje okamžitou extrakci z krevní zkumavky bez čekání na buněčnou kulturu. Frésard et al prokázali u pacientů s 16 různými mendelovskými patologiemi, že RNA-seq na krevních buňkách identifikovala diagnózu u 7,5 % testovaných pacientů (Frésard et al, 2019). Jejich přístup odhalil jak variace výrazu, tak anomálie sestřihu.

Navrhujeme proto provést transkriptovou studii s použitím vysoce výkonného sekvenování RNA (RNA-Seq), paralelně na RNA extrahované z fibroblastů a na RNA extrahované z krevních buněk, na 10 pacientech s podezřením na mitochondriální onemocnění, u kterých byly varianty s nejistým významem v byly identifikovány kandidátní geny (VSI+).

Rozhodli jsme se zaměřit naši studii na pacienty s VSI+, které dříve identifikovala NGS, abychom usnadnili interpretaci dat RNA-Seq v rámci „pilotní“ studie. U těchto pacientů, kteří nesou varianty v kandidátních genech, zaměříme naši bioinformatickou analýzu na tyto geny. Pro interpretaci VSI+ je proveditelný i cílený přístup pomocí Sangerova sekvenování na základě RT-PCR, případně kvantifikace genové exprese pomocí kvantitativní PCR, ale vyžaduje vlastní vývoj pro každou variantu, což je časově velmi náročné a nezanedbatelné náklady. Výhodou přístupu RNA-seq je to, že homogenizuje diagnostickou strategii pro pacienty, šetří čas analýzy, a proto snižuje čas strávený diagnostickým blouděním. A konečně, drastické snížení nákladů na sekvenování NGS znamená, že tato technika by mohla být rutinně používána jako doplněk k sekvenování exomu/genomu. Mohlo by se tedy případně aplikovat nejen na pacienty s VSI+, ale při absenci důkazů o potenciálně patogenních variantách také jako pomůcka pro filtrování variant identifikovaných WES/WGS.