미토콘드리아 질환의 진단 난국 해결: 섬유아세포 및 혈액 세포의 전사체 접근법 (RNAseq)

차세대 시퀀싱(NGS), 특히 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 또는 게놈 시퀀싱(WGS)은 유전자 진단을 상당히 향상시키는 중요한 기술 발전을 가능하게 했습니다. 그러나 약 50%의 환자는 여전히 진단을 받지 못한 상태로 진단이 어려운 상태에 있습니다. 이것의 원인 중 하나는 전사체 발현 및/또는 RNA 스플라이싱을 수정하는 병원성 변종입니다. 이러한 변이체는 깊은 인트론 또는 유전자간 영역, 코딩 서열, 동의어 또는 미스센스 변이체에 위치할 수 있으며 스플라이싱 또는 유전자 발현에 병원성 결과를 가져올 수도 있습니다. 종종 불확실한 중요성(VSI)의 변종으로 남아 있는 이러한 변종의 병원성을 해석하는 것은 매우 어렵습니다. MM의 유전적 진단에서 전사체 시퀀싱(RNA-seq)의 유용성은 최근 몇 년 동안 여러 팀에 의해 10~35%의 진단 수율로 입증되었습니다(Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). MM은 근육, 심장, 뇌 또는 간과 같이 에너지 대사가 높은 조직에서 가장 자주 발현되므로 이러한 연구는 근육 조직을 사용하여 이상적으로 수행됩니다(Cummings et al. 2017). 그러나 이러한 조직의 생검을 얻기가 어렵기 때문에 대부분의 전사체 연구는 피부 생검에서 얻은 섬유아세포를 사용하여 수행됩니다(Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). 실제로, 섬유아세포에 대한 생리학적 결과가 무시할 수 있을지라도 발현 손실이나 비정상적인 접합과 같은 극단적인 조절 결함이 섬유아세포에서 검출될 수 있습니다. 그러나 일부 환자들은 이러한 생검을 거부하고 확인된 변종의 병원성을 확인하기 위한 기능적 분석이 없으면 진단의 불확실한 상태에 머물 수도 있습니다. PAXGene 튜브의 혈액 세포에서 추출한 RNA를 사용하여 RNA 연구를 수행할 수도 있습니다(Frésard et al, 2019). 추출된 RNA의 양은 섬유아세포에서 추출한 것보다 적지만 이러한 유형의 분석은 (i) 더 침습적인 절차를 피하고, (ii) 세포 배양과 관련된 조작을 피하여 기술적 시간을 절약하고, (iii) 세포 배양을 기다리지 않고 혈액 튜브에서 즉시 추출이 가능합니다. Frésard 등은 16가지 다른 멘델 병리학을 가진 환자에서 혈액 세포의 RNA-seq이 테스트된 환자의 7.5%에서 진단을 확인했음을 보여주었습니다(Frésard et al, 2019). 그들의 접근 방식은 발현 변화와 접합 이상을 모두 드러냈습니다.

따라서 우리는 섬유아세포에서 추출한 RNA와 혈액 세포에서 추출한 RNA에 대해 동시에 고처리량 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 사용하여 미토콘드리아 질환이 의심되는 환자 10명에 대한 전사체 연구를 수행할 것을 제안합니다. 후보 유전자(VSI+)가 확인되었습니다.

우리는 "파일럿" 연구의 틀 내에서 RNA-Seq 데이터의 해석을 용이하게 하기 위해 이전에 NGS로 식별된 VSI+ 환자에 대한 연구를 목표로 하기로 결정했습니다. 후보 유전자에 변이가 있는 환자들에 대해 우리는 이러한 유전자에 대한 생물정보학 분석에 중점을 둘 것입니다. VSI+ 해석의 경우 RT-PCR을 기반으로 한 Sanger 시퀀싱을 사용한 표적 접근 방식이나 정량적 PCR을 사용한 유전자 발현 정량화도 가능하지만 각 변이체에 대한 맞춤형 개발이 필요하므로 시간이 많이 걸리고 비용도 크게 들지 않습니다. RNA-seq 접근법의 장점은 환자를 위한 진단 전략을 균질화하고 분석 시간을 절약하여 진단 방황에 소요되는 시간을 줄이는 것입니다. 마지막으로, NGS 시퀀싱 비용의 급격한 감소는 이 기술이 엑솜/게놈 시퀀싱의 보완재로 일상적으로 사용될 수 있음을 의미합니다. 따라서 이는 결국 VSI+ 환자뿐만 아니라 잠재적으로 병원성 변이의 증거가 없는 경우 WES/WGS에 의해 식별된 변이를 필터링하는 데 도움이 되는 환자에게도 적용될 수 있습니다.