Zwalczanie impasu diagnostycznego w chorobach mitochondrialnych: podejście transkryptomiczne w fibroblastach i komórkach krwi (RNAseq)

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), a w szczególności sekwencjonowanie całego egzomu (WES) lub sekwencjonowanie genomu (WGS), umożliwiło znaczny postęp techniczny, który znacznie poprawił diagnostykę genetyczną. Jednak około 50% pacjentów nadal pozostaje niezdiagnozowanych i znajduje się w zawieszeniu diagnostycznym. Jedną z przyczyn tego są patogenne warianty, które modyfikują ekspresję transkryptu i/lub składanie RNA. Warianty te mogą być zlokalizowane w głębokich regionach intronowych lub międzygenowych, lub w sekwencji kodującej, w wariantach synonimicznych lub w wariantach zmiany sensu, co również ma patogenne konsekwencje dla splicingu lub ekspresji genów. Bardzo często trudno jest zinterpretować patogeniczność tych wariantów, które często pozostają wariantami o niepewnym znaczeniu (VSI). W ostatnich latach kilka zespołów wykazało przydatność sekwencjonowania transkryptomu (RNA-seq) w diagnostyce genetycznej MM, a wydajność diagnostyczna waha się od 10% do 35% (Cummings i in. 2017; Kremer i in. 2017; Alston i in. , 2018). Badania te najlepiej przeprowadzić na tkance mięśniowej, ponieważ MM najczęściej ulegają ekspresji w tkankach o wysokim metabolizmie energetycznym, takich jak mięśnie, serce, mózg czy wątroba (Cummings i in. 2017). Ponieważ jednak biopsje tych tkanek są trudne do uzyskania, większość badań transkryptów przeprowadza się przy użyciu fibroblastów uzyskanych z biopsji skóry (Kremer i in. 2017, Saadi i in., 2022). Rzeczywiście, w fibroblastach można wykryć skrajne defekty regulacyjne, takie jak utrata ekspresji lub nieprawidłowy splicing, nawet jeśli fizjologiczne konsekwencje dla fibroblastów mogą być znikome. Jednak niektórzy pacjenci również odmawiają wykonania biopsji i mogą pozostać w zawieszeniu diagnostycznym w przypadku braku analizy funkcjonalnej potwierdzającej patogeniczność zidentyfikowanych wariantów. Badania RNA można również przeprowadzić przy użyciu RNA ekstrahowanego z komórek krwi w probówkach PAXGene (Frésard i in., 2019). Ilość wyekstrahowanego RNA jest mniejsza niż ilość wyekstrahowanego z fibroblastów, ale ten typ analizy (i) pozwala uniknąć bardziej inwazyjnej procedury, (ii) oszczędza czas techniczny, unikając manipulacji związanych z hodowlą komórkową oraz (iii) oszczędza czas na pacjenta, umożliwiając natychmiastową ekstrakcję z probówki z krwią, bez czekania na hodowlę komórkową. Frésard i wsp. wykazali u pacjentów z 16 różnymi patologiami mendlowskimi, że sekwencja RNA na komórkach krwi pozwoliła na rozpoznanie u 7,5% badanych pacjentów (Frésard i in., 2019). Ich podejście ujawniło zarówno różnice w ekspresji, jak i anomalie splicingu.

Dlatego proponujemy przeprowadzenie badania transkryptu przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq), równolegle na RNA ekstrahowanym z fibroblastów i RNA ekstrahowanym z komórek krwi, u 10 pacjentów z podejrzeniem choroby mitochondrialnej, u których warianty o niepewnym znaczeniu w Zidentyfikowano geny kandydujące (VSI+).

Zdecydowaliśmy się skierować nasze badanie na pacjentów z VSI+, wcześniej zidentyfikowanych przez NGS, aby ułatwić interpretację danych RNA-Seq w ramach badania „pilotażowego”. W przypadku tych pacjentów, którzy są nosicielami wariantów genów kandydujących, nasza analiza bioinformatyczna skupi się na tych genach. Do interpretacji VSI+ możliwe jest również ukierunkowane podejście wykorzystujące sekwencjonowanie Sangera w oparciu o RT-PCR lub ilościowe oznaczenie ekspresji genów za pomocą ilościowej PCR, ale wymaga niestandardowego opracowania dla każdego wariantu, co jest bardzo czasochłonne i nie bez znaczenia drogie. Zaletą podejścia opartego na seq RNA jest to, że ujednolica ono strategię diagnostyczną dla pacjentów, oszczędza czas analizy, a tym samym skraca czas błąkania się w diagnostyce. Wreszcie drastyczne obniżenie kosztów sekwencjonowania NGS oznacza, że ​​technika ta może być stosowana rutynowo jako uzupełnienie sekwencjonowania egzomu/genomu. Można zatem ostatecznie zastosować ją nie tylko u pacjentów z VSI+, ale także, w przypadku braku dowodów na obecność potencjalnie patogennych wariantów, jako pomoc w filtrowaniu wariantów zidentyfikowanych za pomocą WES/WGS.