Combatir el estancamiento diagnóstico en las enfermedades mitocondriales: un enfoque transcriptómico en fibroblastos y células sanguíneas (RNAseq)

La secuenciación de próxima generación (NGS), y en particular la secuenciación del exoma completo (WES) o secuenciación del genoma (WGS), ha permitido un importante avance técnico que ha mejorado considerablemente el diagnóstico genético. Sin embargo, alrededor del 50% de los pacientes aún no han sido diagnosticados y se encuentran en un limbo diagnóstico. Una de las causas de esto son las variantes patogénicas que modifican la expresión de la transcripción y/o el empalme del ARN. Estas variantes pueden estar localizadas en regiones intrónicas o intergénicas profundas, o en la secuencia codificante, variantes sinónimas o sin sentido, teniendo también consecuencias patogénicas sobre el empalme o la expresión génica. Muy a menudo resulta difícil interpretar la patogenicidad de estas variantes, que a menudo siguen siendo variantes de significado incierto (VSI). La utilidad de la secuenciación del transcriptoma (RNA-seq) en el diagnóstico genético del MM ha sido demostrada en los últimos años por varios equipos con rendimientos diagnósticos del 10% al 35% (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Lo ideal es que estos estudios se realicen utilizando tejido muscular, ya que los MM se expresan con mayor frecuencia en tejidos con un metabolismo energético elevado, como el músculo, el corazón, el cerebro o el hígado (Cummings et al. 2017). Sin embargo, como las biopsias de estos tejidos son difíciles de obtener, la mayoría de los estudios de transcripción se realizan utilizando fibroblastos obtenidos de biopsias de piel (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). De hecho, en los fibroblastos se pueden detectar defectos regulatorios extremos, como la pérdida de expresión o el empalme aberrante, aunque las consecuencias fisiológicas en los fibroblastos pueden ser insignificantes. Sin embargo, algunos pacientes también rechazan estas biopsias y pueden permanecer en el limbo diagnóstico en ausencia de análisis funcionales que confirmen la patogenicidad de las variantes identificadas. Los estudios de ARN también se pueden realizar utilizando ARN extraído de células sanguíneas en tubos PAXGene (Frésard et al, 2019). La cantidad de ARN extraído es menor que la extraída de fibroblastos, pero este tipo de análisis (i) evita un procedimiento más invasivo, (ii) ahorra tiempo técnico al evitar las manipulaciones asociadas al cultivo celular, y (iii) ahorra tiempo a la paciente al permitir la extracción inmediata del tubo de sangre sin esperar el cultivo celular. Frésard et al demostraron en pacientes con 16 patologías mendelianas diferentes que RNA-seq en células sanguíneas identificó un diagnóstico en el 7,5% de los pacientes evaluados (Frésard et al, 2019). Su enfoque reveló tanto variaciones de expresión como anomalías de empalme.

Por lo tanto, proponemos realizar un estudio de transcripción mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-Seq), en paralelo con ARN extraído de fibroblastos y con ARN extraído de células sanguíneas, en 10 pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial en los que variantes de significado incierto en Se han identificado genes candidatos (VSI+).

Elegimos centrar nuestro estudio en pacientes con VSI+, previamente identificados por NGS, para facilitar la interpretación de los datos de RNA-Seq en el marco de un estudio "piloto". En estos pacientes, que portan variantes en genes candidatos, centraremos nuestro análisis bioinformático en estos genes. Para la interpretación de VSI+, también es factible un enfoque dirigido que utilice la secuenciación de Sanger basada en RT-PCR, o la cuantificación de la expresión genética mediante PCR cuantitativa, pero requiere un desarrollo personalizado para cada variante, lo que requiere mucho tiempo y no es insignificante. La ventaja de un enfoque de RNA-seq es que homogeneiza la estrategia de diagnóstico para los pacientes, ahorra tiempo de análisis y, por lo tanto, reduce el tiempo dedicado a la deriva diagnóstica. Finalmente, la drástica reducción del coste de la secuenciación NGS significa que esta técnica podría utilizarse de forma rutinaria como complemento a la secuenciación del exoma/genoma. Por lo tanto, eventualmente podría aplicarse no solo a pacientes con VSI+ sino también, en ausencia de evidencia de variantes potencialmente patógenas, como ayuda para filtrar variantes identificadas por WES/WGS.