歯周炎患者における歯肉縁下病原菌に対するアクセスフラップ手術の有効性

本研究の参加者は、2017年の歯周病および症状の分類に関する世界ワークショップで確立された基準によって決定された、ステージIII、グレードBの歯周炎と診断された個人でした。

非外科的歯周治療は、超音波装置 (Cavitron Plus、Dentsply®、デュイスブルク) と併用した歯周用ハンド器具 (Gracey キュレット、Hu-Friedy®、イリノイ州シカゴ) を使用して、研究に参加する予定の患者のすべての象限に施されました。 、ドイツ）。 各患者は非外科的歯周治療の最初のステップを受けました。これには、歯肉縁上の沈着物の機械的除去、動機づけ、および修正バス技術を使用した歯間のプラークコントロールや歯磨きなどの個別の口腔衛生指導が含まれます。 最初のセッション後の最初の週に、歯肉縁下器具（SI）を含む非外科的歯周治療の第 2 ステップが、同じ盲検オペレーターによって 1 回の予約で 4 つの象限すべてに対して実行されました。 患者は処方薬やうがい薬を一切受け取っていなかった。 SI 後の 1 か月後のフォローアップ訪問 (手術の 14 日前) で、患者は臨床的に再検査され、包含/除外基準の遵守が再評価されました。 深い残存ポケット（PD ≥ 6 mm）の存在によって示されるアクセス フラップ手術を必要とする患者が特定され、ランダム化手順を受けました。 歯周手術が予定されている参加患者のさまざまな部位が、無作為化手順を通じてアクセスフラップ手術部位（試験グループ）または未治療部位（対照グループ）のいずれかに割り当てられました。 アクセスフラップ手術が必要ないと判断された他の患者は研究に含まれず、代わりに歯肉縁下器具の反復使用または支持的な歯周ケアプログラムに登録された。

登録訪問中に患者には連続した昇順の番号が割り当てられました。 研究の開始前に、コンピュータ乱数発生器によって生成されたランダムシーケンスを使用して、検査または治療プロセスに直接関与していない研究者によって治療象限の順序がランダム化されました。 割り当ての隠蔽は、連続番号が付けられた不透明な密封封筒を使用して実現されました。 このプロセスに基づいて、右側または左側の部位の歯をテストグループとして指定し、反対側の部位の歯を対照グループに割り当てました。 割り当ては歯周検査と記録の間ずっと検査官には隠されたままであり、封筒は最初の治療来院までオペレーターによって開けられませんでした。

研究基準を満たした各患者は、次のいずれかの治療を受けました。口の片側がAFSで治療され、反対側の四分円は対照として機能しました。 すべてのアクセス手術は、同じ盲検歯周病専門医によって行われた。 局所麻酔後、粘膜骨膜弁が持ち上げられ、簡略化された手順に従って顕微手術器具（ブレード、メス、持針器、ハサミ、およびピンセット、Carl Martin GmbH、ゾーリンゲン、ドイツ）を使用して扱われた。乳頭保存皮弁（SPFF）技術。 歯槽骨に付着した肉芽組織は、完全なアクセスと歯根表面の最適な可視性を確保するために切除されました。 さらに、器具の使用は超音波器具と手動器具の組み合わせを使用して実行され、皮弁処置中に歯槽骨の修正は行われませんでした。 続いて、粘膜骨膜弁を再配置し、モノフィラメント縫合糸材料（５／０ Ｐｒｏｐｉｌｅｎ、Ｄｏｇｓａｎ、Ｔｕｒｋｉｙｅ）を使用する近位の単純な縫合糸で主に閉じた。 患者には術後の推奨事項が与えられました。しかし、薬は処方されませんでした。

プロービング深さ (PD) (mm)、臨床付着レベル (CAL) (mm)、プロービング時出血 (BOP) (±)、歯肉指数 (GI)、およびプラーク指数 (PI) を含む歯周測定値を 2 つの異なる時点で評価しました。実験部位を知らされていない校正済みの歯周病専門医による間隔。20 これらの測定は、各歯の 6 つの異なる側面 (遠心頬側/唇側、中間頬側/唇側、近心頬側/口唇側、遠心舌側/口蓋側、中間舌側/口蓋側、および近心舌側/口蓋側) で行われました。手動歯周プローブ（Williams プローブ、Hu-Friedy®、イリノイ州シカゴ）を使用し、平均値を計算しました。 歯周組織の治癒を評価するために、アクセスフラップ手術の前後4週間に詳細な歯周スコアを記録しました。

各患者について記録された歯周スコアのうち、最高スコア（PD ≥ 6 mm、CAL ≥ 5 mm）を示した 4 つの歯（治療グループで 2 つ、対照グループで 2 つ）を歯肉縁下プラークサンプリングのドナー部位として指定しました。 サンプルの収集は、臨床測定の実施を担当する研究者によって手術前と手術後 1 か月で行われました。 滅菌綿ロールを使用してサンプリング部位を分離し、続いて歯の表面から歯肉縁上のプラークを除去しました。 続いて、滅菌済みペーパーポイント (Paperpoint #50、EndoPoint®、パライバ ド スル州、ブラジル、ブラジル) を指定された歯周ポケットに慎重に挿入し、軽い抵抗に遭遇するまで穏やかな圧力を加えました。 ペーパーポイントを歯周ポケット内に 20 秒間保持した後、滅菌微量遠心管に慎重に移し、保管のためにしっかりと蓋をしました。 サンプルは、Trakya University Technology Research and Development Application Center の -80°C 冷凍庫に保管されました。

歯肉縁下の歯周病原菌の分子遺伝学的同定と定量化は、グループ分布を知らされていないオペレーターによって行われました。 PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN、マサチューセッツ州、米国) を DNA 単離に使用しました。 1.5 ml 遠心分離管内のサンプルは、-80 °C の冷凍庫から取り出した後、室温で解凍して溶解しました。 DNA 単離は、細胞溶解、フィルター膜への DNA 結合、洗浄、および溶出の一連のステップを含む製造業者の指示に従って進められました。 続いて、サンプルを含むチューブを 21,300 x g で 1 分間遠心分離して、微生物の純粋なゲノム DNA を取得しました。 これらの単離された DNA サンプルは、PCR 段階まで -20 ℃で保存されました。

リアルタイム定量的 PCR 法では、5' および 3' 末端が蛍光色素 (蛍光物質) で標識された TaqMan® プローブ (Applied Biosystems™、カリフォルニア州、米国) が利用されました。 TaqMan Multiplex Master キットは、プライマーとプローブ以外に、qPCR を実行するために必要なすべてのコンポーネントをあらかじめ混合した便利なキットです。 DNA ポリメラーゼ、dNTP (アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、チミジン三リン酸、シチジン三リン酸)、KCL または MgCL2、およびポリメラーゼ バッファーが含まれています。 この技術の目的は、既知のゲノム、プラスミド、または相補 DNA (cDNA) 配列を定性的および定量的に検出することです。

PCR分析のために、20μlのマスターミックス(Applied Biosystems™、カリフォルニア州、米国)を96ウェルマイクロプレートに入れました。 次に、各症例から採取した DNA サンプル 5 μl をテストとしてこれらのウェルの一部に加え、研究には含まれていない 3 人の健康な患者から採取したサンプル 5 μl を残りのウェルに加えました。内部対照として機能するウェル。 それぞれ総量 25 μL のこれらの混合物を PCR 装置 (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System、Applied Biosystems™、カリフォルニア州、米国) で実行しました。qPCR 研究プロトコルには次のステップが含まれていました: ポリメラーゼ活性化ステップ ( 95 °C で 3 分間 1 サイクル）、変性ステップ（95 °C で 15 秒間 40 サイクル）、およびアニーリング/伸長ステップ (5 °C で 30 秒間 40 サイクル)。

qPCR 法の文脈では、サイクル数の増加は、蛍光色素によって検出される DNA 量の付随的な増加に対応します。 閾値サイクル値 (Ct) は、増幅中に蛍光放射が所定の閾値を超えるサイクル数を指します。 本研究では、歯肉縁下プラークサンプルの分析結果から得られたCt値を2-ΔCt式に統合し、微生物量の変化倍数の差を計算しました。ベースラインと検出された対象細菌間の差異最初の月は次の式を使用して計算されました。

ΔCt: [1 か月目の標的細菌の Ct] - [ベースラインの標的細菌の Ct] ベースラインと比較した 1 か月目の標的細菌の量の変化倍数: 2-ΔΔCt すべての分析は、SPSS バージョン 23 ソフトウェア パッケージ (IBM) を使用して実行されました。コープ、ニューヨーク州アーモンク）。 試験グループと対照グループの 2 つのグループは、微生物量の実質的な効果サイズ (0.4) の差と 0.05 の有意水準で定義されました。 相関係数 0.5 で反復測定の相関関係を評価するために、G*Power 3.1.9.2 ソフトウェアを使用して 40 ケース (テスト 20 - 対照 20) のサンプル サイズを決定しました。 有意水準は p < 0.05 に設定されました。

連続変数は、Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性について評価されました。 続いて、正規分布の仮定に基づいて、Student の t 検定または Mann-Whitney U 検定のいずれかを使用して、独立したグループ間の比較を実行しました。 依存グループ間の比較のために、分析では対応のある t 検定またはウィルコクソン検定を使用しました。

連続変数間の相関は、スピアマン相関分析によって調査されました。 連続変数は平均 ± 標準偏差 (SD)、中央値 (四分位範囲 (IQR))、範囲 (最小値-最大値) で表され、カテゴリ変数は頻度とパーセンテージで表されました。