Skuteczność chirurgii płatowej dostępu w leczeniu poddziąsłowych patogenów przyzębia u osób z zapaleniem przyzębia

Uczestnikami niniejszego badania były osoby, u których zdiagnozowano zapalenie przyzębia w stopniu III stopnia B, zgodnie z kryteriami ustalonymi w Światowych Warsztatach Klasyfikacji Chorób i Schorzeń Przyzębia z 2017 roku.

Niechirurgiczne leczenie przyzębia przeprowadzono we wszystkich ćwiartkach pacjentów zaplanowanych do udziału w badaniu, stosując ręczne instrumenty periodontologiczne (kirety Gracey, Hu-Friedy®; Chicago, IL) w połączeniu z urządzeniem ultradźwiękowym (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg , Niemcy). Każdy pacjent przeszedł pierwszy etap niechirurgicznego leczenia periodontologicznego, który obejmował mechaniczne usunięcie złogu naddziąsłowego, motywację oraz spersonalizowany instruktaż higieny jamy ustnej, obejmujący kontrolę płytki międzyzębowej i szczotkowanie zębów zmodyfikowaną techniką Bassa. W pierwszym tygodniu po pierwszej sesji wykonano drugi etap niechirurgicznego leczenia przyzębia, który obejmował instrumentację poddziąsłową (SI), we wszystkich czterech kwadrantach podczas jednej wizyty prowadzonej przez tego samego zaślepionego operatora. Pacjenci nie otrzymywali przepisanych leków ani płynów do płukania jamy ustnej. Podczas miesięcznej wizyty kontrolnej po MS (14 dni przed operacją) pacjentów poddano ponownemu badaniu klinicznemu i ocenie zgodności z kryteriami włączenia/wyłączenia. Zidentyfikowano pacjentów wymagających operacji płatowej, na co wskazywała obecność głębokich kieszonek resztkowych (PD ≥ 6 mm) i poddano procedurze randomizacji. Różne miejsca uczestniczących pacjentów zaplanowanych na operację przyzębia zostały przydzielone albo jako miejsca operacji klap dostępowych (grupa testowa), albo miejsca nieleczone (grupa kontrolna) w drodze procedury randomizacji. Inni pacjenci, u których uznano, że nie wymagają operacji klapami dostępowymi, nie zostali włączeni do badania i zamiast tego zostali włączeni do powtarzanego leczenia poddziąsłowego lub do programu wspomagającej opieki przyzębia.

Podczas wizyty rejestracyjnej pacjentom przydzielano kolejne, rosnące numery. Przed rozpoczęciem badania kolejność ćwiartek leczenia była ustalana losowo przez badacza niezaangażowanego bezpośrednio w badanie lub proces leczenia, przy użyciu losowych sekwencji generowanych przez komputerowy generator liczb losowych. Ukrycie alokacji osiągnięto za pomocą nieprzezroczystych, zapieczętowanych kopert, numerowanych sekwencyjnie. Na tej podstawie zęby po stronie prawej lub lewej zostały wyznaczone jako grupa testowa, natomiast zęby po stronie przeciwnej przydzielono do grupy kontrolnej. Przydział pozostawał w tajemnicy przed lekarzem przez cały czas trwania badania periodontologicznego i zapisów, a koperta została otwarta przez operatora dopiero na pierwszej wizycie leczniczej.

Każdy pacjent spełniający kryteria badania został poddany jednemu z poniższych badań: jedna strona jamy ustnej była leczona AFS, natomiast przeciwległy kwadrant służył jako kontrola. Wszystkie operacje dostępowe przeprowadził ten sam zaślepiony periodontolog. Po znieczuleniu miejscowym uniesiono płat śluzowo-okostnowy i operowano go instrumentami mikrochirurgicznymi (ostrza, skalpel, uchwyt igły, nożyczek i pęseta, Carl Martin GmbH, Solingen, Niemcy) zgodnie z uproszczoną metodą technika płata chroniącego brodawkę (SPFF). Wycięto ziarninę przyczepioną do kości wyrostka zębodołowego, aby zapewnić pełny dostęp i optymalną widoczność powierzchni korzeni. Ponadto wykonano oprzyrządowanie przy użyciu kombinacji instrumentów ultradźwiękowych i ręcznych, a podczas zabiegu płatowego nie podjęto żadnych modyfikacji kości wyrostka zębodołowego. Następnie zmieniono położenie płata śluzówkowo-okostnowego i pierwotnie zamknięto go prostymi szwami proksymalnymi z użyciem materiału monofilamentowego (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Pacjentom przekazano zalecenia pooperacyjne; jednakże nie przepisano żadnego leku.

Pomiary przyzębia, w tym głębokość sondowania (PD) (mm), kliniczny poziom przyczepu (CAL) (mm), krwawienie przy sondowaniu (BOP) (±), wskaźnik dziąseł (GI) i wskaźnik płytki nazębnej (PI) oceniano w dwóch różnych momentach odstępach czasu przez skalibrowanego periodontologa, który nie widział miejsc doświadczalnych.20 Pomiary te przeprowadzono w sześciu różnych obszarach każdego zęba (dystalny/policzkowy/wargowy, środkowy policzkowy/wargowy, mezjalno-policzkowy/wargowy, dystalny/językowy/podniebienny, środkowy językowy/podniebienny i mezjalno-językowy/podniebienny) przy użyciu ręczną sondę periodontologiczną (sonda Williams, Hu-Friedy®; Chicago, IL) i obliczono wartość średnią. Aby ocenić gojenie się tkanek przyzębia, zapisywano szczegółową ocenę stanu przyzębia przed operacją klapy dostępowej i cztery tygodnie po niej.

Spośród punktacji periodontologicznej zarejestrowanej dla każdego pacjenta cztery zęby (dwa w grupie leczonej i dwa w grupie kontrolnej) wykazujące najwyższe wyniki (PD ≥6 mm, CAL ≥5 mm) zostały wyznaczone jako miejsca pobrania próbki płytki poddziąsłowej. Pobieranie próbek odbywało się przed i miesiąc po zabiegu przez badacza odpowiedzialnego za wykonywanie pomiarów klinicznych. Miejsca pobierania próbek izolowano za pomocą sterylnych wałków bawełnianych, a następnie usuwano naddziąsłową płytkę nazębną z powierzchni zęba. Następnie sterylizowane ćwieki papierowe (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraiba do Sul, RJ, Brazylia) delikatnie wprowadzono do wyznaczonych kieszonek przyzębnych, wywierając delikatny nacisk aż do napotkania łagodnego oporu. Papierowe ćwieki trzymano w kieszonce przyzębnej przez 20 sekund, po czym ostrożnie przenoszono je do sterylnych probówek do mikrowirówki, bezpiecznie zamkniętych w celu przechowywania. Próbki przechowywano w zamrażarce o temperaturze -80°C w Centrum Badań i Rozwoju Technologii Uniwersytetu w Trakya.

Molekularną identyfikację genetyczną i ocenę ilościową poddziąsłowych periodontopatogenów przeprowadził operator, który nie był świadomy rozkładu grupowego. Do izolacji DNA wykorzystano zestaw PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, USA). Próbki w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml rozmrożono w temperaturze pokojowej w celu rozpuszczenia po wyjęciu z zamrażarki o temperaturze -80°C. Izolacja DNA przebiegała zgodnie z instrukcjami producenta, obejmując kolejne etapy lizy komórek, wiązania DNA z membranami filtrów, przemywania i elucji. Następnie probówki zawierające próbki poddano wirowaniu przy 21 300 x g przez 1 minutę w celu uzyskania czystego genomowego DNA mikroorganizmów. Te wyizolowane próbki DNA przechowywano w temperaturze -20˚C aż do etapu PCR.

W ramach metodologii ilościowej PCR w czasie rzeczywistym wykorzystano sondy TaqMan® (Applied Biosystems™, Kalifornia, USA) znakowane fluorochromami (substancjami fluorescencyjnymi) na końcach 5' i 3'. Zestaw TaqMan Multiplex Master to wygodna mieszanka wstępna wszystkich składników niezbędnych, oprócz starterów i sond, do przeprowadzenia qPCR. Zawiera polimerazę DNA, dNTP (trifosforan adenozyny, trifosforan guanozyny, trifosforan tymidyny, trifosforan cytydyny), KCL lub MgCL2 i bufor polimerazy. Celem tej technologii jest wykrywanie znanych sekwencji genomowych, plazmidowych lub komplementarnych DNA (cDNA) zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym.

Do analiz PCR 20 µl master mixu (Applied Biosystems™, Kalifornia, USA) umieszczono w 96-dołkowych mikropłytkach. Następnie do niektórych z tych dołków dodano po 5 µl próbki DNA pobranej od każdego przypadku w celu przeprowadzenia testu, a do pozostałych po 5 µl próbki pobranej od 3 zdrowych pacjentów, którzy nie zostali włączeni do badania. studnie służące jako kontrola wewnętrzna. Mieszaniny te, każda o całkowitej objętości 25 µl, poddano działaniu aparatu do PCR (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, Kalifornia, USA). Protokół badania qPCR obejmował następujące etapy: etap aktywacji polimerazy ( 1 cykl w 95°C przez 3 min), etap denaturacji (40 cykli w 95°C przez 15 s) i etap wyżarzania/wydłużania (40 cykli w 5°C przez 30 s).

W kontekście metody qPCR wzrost liczby cykli odpowiada jednoczesnemu wzrostowi ilości DNA wykrywanego przez barwnik fluorescencyjny. Wartość progowa cyklu (Ct) odnosi się do liczby cykli, przy której promieniowanie fluorescencyjne przekracza z góry określony próg podczas amplifikacji. W niniejszym badaniu wartości Ct uzyskane z wyników analizy próbek płytki poddziąsłowej włączono do wzoru 2-ΔCt w celu obliczenia różnicy w krotności zmiany występującej w ilościach mikroorganizmów. Rozbieżność pomiędzy docelowymi bakteriami wykrytymi na początku i na początku pierwszy miesiąc został obliczony przy użyciu następującego wzoru:

ΔCt: [Ct_bakterie docelowe w 1. miesiącu] - [Ct_bakterie docelowe w linii podstawowej] Krotna zmiana ilości bakterii docelowych w 1. miesiącu w porównaniu z wartością wyjściową: 2-Δ∆Ct Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu pakietu oprogramowania SPSS wersja 23 (IBM Corp, Armonk, Nowy Jork). Zdefiniowano dwie grupy, testową i kontrolną, ze znaczącą różnicą w wielkości efektu (0,4) w ilościach drobnoustrojów i poziomem istotności 0,05. Aby ocenić korelacje w powtarzanych pomiarach ze współczynnikiem korelacji 0,5, określono wielkość próby 40 przypadków (20 testów - 20 kontroli) za pomocą oprogramowania G*Power 3.1.9.2. Poziom istotności przyjęto na poziomie p < 0,05.

Zmienne ciągłe oceniano pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka. Następnie, w oparciu o założenie rozkładu normalnego, przeprowadzono porównania pomiędzy niezależnymi grupami za pomocą testu t-Studenta lub testu U Manna-Whitneya. Do porównań między grupami zależnymi w analizach wykorzystano test t dla par lub test Wilcoxona.

Korelację pomiędzy zmiennymi ciągłymi badano za pomocą analizy korelacji Spearmana. Zmienne ciągłe opisano w kategoriach średniej ± odchylenie standardowe (SD), mediany (rozstęp międzykwartylowy (IQR)) i zakresu (minimum-maksimum), natomiast zmienne kategoryczne przedstawiono za pomocą częstotliwości i wartości procentowej.