Eficácia da cirurgia de retalho de acesso em perindontopatógenos subgengivais em indivíduos com periodontite

Os participantes do presente estudo foram indivíduos com diagnóstico de periodontite grau B em estágio III, conforme determinado pelos critérios estabelecidos no Workshop Mundial para Classificação de Doenças e Condições Periodontais de 2017.

O tratamento periodontal não cirúrgico foi administrado a todos os quadrantes em pacientes programados para participar do estudo, utilizando instrumentos manuais periodontais (curetas Gracey, Hu-Friedy®; Chicago, IL) em conjunto com um dispositivo ultrassônico (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg , Alemanha). Cada paciente foi submetido à primeira etapa do tratamento periodontal não cirúrgico, que envolveu a remoção mecânica de depósitos supragengivais, motivação e instruções personalizadas de higiene bucal, incluindo controle de placa interdental e escovação dentária utilizando a técnica de Bass modificada. Na primeira semana após a sessão inicial, a segunda etapa do tratamento periodontal não cirúrgico, que englobou a instrumentação subgengival (SI), foi realizada em todos os quatro quadrantes em uma única consulta administrada pelo mesmo operador cego. Os pacientes não receberam nenhum medicamento prescrito ou enxaguatório bucal. Na consulta de acompanhamento de um mês após a SI (14 dias pré-operatório), os pacientes foram reexaminados clinicamente e sua conformidade com os critérios de inclusão/exclusão foi reavaliada. Os pacientes que necessitaram de cirurgia de retalho de acesso, indicada pela presença de bolsas residuais profundas (PD ≥ 6 mm), foram identificados e submetidos ao procedimento de randomização. Diferentes locais dos pacientes participantes agendados para cirurgia periodontal foram designados como locais de cirurgia de retalho de acesso (grupo de teste) ou locais não tratados (grupo de controle) através de um procedimento de randomização. Outros pacientes que não necessitaram de cirurgia de retalho de acesso não foram incluídos no estudo e, em vez disso, foram inscritos em instrumentação subgengival repetida ou em um programa de tratamento periodontal de suporte.

Os pacientes receberam números ascendentes consecutivos durante a visita de inscrição. Antes do início do estudo, a ordem dos quadrantes de tratamento foi randomizada por um investigador não diretamente envolvido no processo de exame ou tratamento, usando sequências aleatórias geradas por um gerador de números aleatórios de computador. A ocultação da alocação foi realizada por meio de envelopes lacrados opacos, numerados sequencialmente. Com base nesse processo, os dentes do local direito ou esquerdo foram designados como grupo teste, enquanto os do local oposto foram designados para o grupo controle. A alocação permaneceu escondida do examinador durante todo o exame periodontal e gravações, e o envelope não foi aberto pelo operador até a primeira consulta de tratamento.

Cada paciente que atendeu aos critérios do estudo foi submetido a um dos seguintes procedimentos: um lado da boca foi tratado com AFS, enquanto os quadrantes contralaterais serviram como controle. Todas as cirurgias de acesso foram realizadas pelo mesmo periodontista cego. Após anestesia local, o retalho mucoperiosteal foi elevado e manuseado com instrumentos microcirúrgicos (lâminas, bisturi, porta-agulha, tesoura e pinça, Carl Martin GmbH, Solingen, Alemanha) de acordo com o procedimento simplificado Técnica do retalho de preservação da papila (SPFF). O tecido de granulação ligado ao osso alveolar foi excisado para garantir acesso completo e visibilidade ideal das superfícies radiculares. Além disso, a instrumentação foi realizada utilizando uma combinação de instrumentos ultrassônicos e manuais, e nenhuma modificação óssea alveolar foi realizada durante o procedimento do retalho. Posteriormente, o retalho mucoperiosteal foi reposicionado e fechado primariamente com suturas simples proximais utilizando material de sutura monofilamentar (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Os pacientes receberam recomendações pós-operatórias; no entanto, nenhum medicamento foi prescrito.

Medições periodontais incluindo profundidade de sondagem (PD) (mm), nível de inserção clínica (CAL) (mm), sangramento à sondagem (BOP) (±), índice gengival (GI) e índice de placa (PI) foram avaliadas em dois momentos distintos. intervalos por um periodontista calibrado que desconhecia os locais experimentais.20 Essas medições foram realizadas em seis aspectos diferentes de cada dente (disto-vestibular/labial, médio-vestibular/labial, mésio-vestibular/labial, disto-lingual/palatina, médio-lingual/palatina e mésio-lingual/palatina) usando uma sonda periodontal manual (sonda Williams, Hu-Friedy®; Chicago, IL), e o valor médio foi calculado. Para avaliar a cicatrização dos tecidos periodontais, foram registrados escores periodontais detalhados antes e quatro semanas após a cirurgia do retalho de acesso.

Entre as pontuações periodontais registradas para cada paciente, quatro dentes (dois para o grupo de tratamento e dois para o grupo controle) demonstrando as pontuações mais altas (PD ≥6 mm, CAL ≥5 mm) foram designados como áreas doadoras para amostragem de placa subgengival. A coleta das amostras foi realizada antes e um mês após a cirurgia pelo investigador responsável pela realização das medidas clínicas. Os locais de amostragem foram isolados com rolos de algodão estéreis, seguido pela remoção da placa supragengival da superfície dentária. Posteriormente, pontas de papel esterilizadas (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraíba do Sul, RJ, Brasil) foram delicadamente inseridas nas bolsas periodontais designadas, exercendo leve pressão até encontrar leve resistência. As pontas de papel foram retidas na bolsa periodontal por 20 segundos antes de serem cuidadosamente transferidas para tubos de microcentrífuga estéreis, tampados com segurança para armazenamento. As amostras foram armazenadas em um freezer a -80°C no Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Tecnologia da Universidade Trakya.

A identificação genética molecular e quantificação de periodontopatógenos subgengivais foram realizadas por um operador que desconhecia a distribuição dos grupos. O PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, EUA) foi empregado para isolamento de DNA. As amostras dentro de tubos de centrífuga de 1,5 ml foram descongeladas à temperatura ambiente para dissolução após serem retiradas do freezer a -80°C. O isolamento do DNA ocorreu de acordo com as instruções do fabricante, envolvendo etapas sequenciais de lise celular, ligação do DNA às membranas do filtro, lavagem e eluição. Posteriormente, os tubos contendo as amostras foram centrifugados a 21.300 x g por 1 minuto para obtenção de DNA genômico puro dos microrganismos. Essas amostras de DNA isoladas foram preservadas a -20˚C até a etapa de PCR.

Dentro da metodologia de PCR quantitativa em tempo real, foram utilizadas sondas TaqMan® (Applied Biosystems™, CA, EUA) marcadas com fluorocromos (substâncias fluorescentes) nos terminais 5' e 3'. O kit TaqMan Multiplex Master é uma pré-mistura conveniente de todos os componentes necessários, além de primers e sondas, para realizar qPCR. Contém DNA polimerase, dNTPs (adenosina trifosfato, guanosina trifosfato, timidina trifosfato, citidina trifosfato), KCL ou MgCL2 e tampão polimerase. O objetivo desta tecnologia é detectar sequências genômicas, plasmídicas ou de DNA complementar (cDNA) conhecidas, tanto qualitativa quanto quantitativamente.

Para análises de PCR, 20 μl de master mix (Applied Biosystems™, CA, EUA) foram colocados em microplacas de 96 poços. Em seguida, 5 μl da amostra de DNA retirada de cada caso foram adicionados a alguns desses poços para servir de teste, enquanto 5 μl da amostra retirada de 3 pacientes saudáveis, que não foram incluídos no estudo, foram adicionados aos restantes. poços para servir como controle interno. Essas misturas, cada uma com volume total de 25 μL, foram executadas na máquina de PCR (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, CA, EUA). O protocolo do estudo qPCR incluiu as seguintes etapas: uma etapa de ativação da polimerase ( 1 ciclo a 95°C por 3 min), uma etapa de desnaturação (40 ciclos a 95°C por 15 s) e uma etapa de recozimento/extensão (40 ciclos a 5°C por 30 s).

No contexto do método qPCR, um aumento no número de ciclos corresponde a um aumento concomitante na quantidade de DNA detectado pelo corante fluorescente. O valor do ciclo limite (Ct) refere-se ao número do ciclo no qual a radiação de fluorescência ultrapassa um limite predeterminado durante a amplificação. No presente estudo, os valores de Ct obtidos a partir dos resultados da análise de amostras de placa subgengival foram integrados na fórmula 2-ΔCt para calcular a diferença na mudança de dobra que ocorre nas quantidades de microrganismos. o 1º mês foi calculado utilizando a seguinte fórmula:

ΔCt: [Ct_bactérias alvo no 1º mês] - [Ct_bactérias alvo na linha de base] A mudança nas quantidades das bactérias alvo no 1º mês em comparação com a linha de base: 2-Δ∆Ct Todas as análises foram conduzidas usando o pacote de software SPSS versão 23 (IBM Corp, Armonk, NY). Dois grupos, teste e controle, foram definidos com uma diferença substancial de tamanho de efeito (0,4) nas quantidades microbianas e um nível de significância de 0,05. Para avaliar correlações em medidas repetidas com coeficiente de correlação de 0,5, um tamanho de amostra de 40 casos (20 testes - 20 controles) foi determinado usando o software G*Power 3.1.9.2. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05.

As variáveis ​​contínuas foram avaliadas quanto à normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk. Posteriormente, com base na suposição de distribuição normal, as comparações entre grupos independentes foram realizadas utilizando o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney. Para comparações entre grupos dependentes, as análises empregaram o teste t pareado ou o teste de Wilcoxon.

A correlação entre variáveis ​​contínuas foi investigada através da análise de correlação de Spearman. As variáveis ​​contínuas foram descritas em termos de média ± desvio padrão (DP), mediana (intervalo interquartil (IQR)) e intervalo (mínimo-máximo), enquanto as variáveis ​​categóricas foram representadas por frequência e porcentagem.