Účinnost operace přístupových laloků na subgingivální peridontopatgogeny u jedinců s parodontitidou

Účastníky této studie byli jedinci s diagnózou paradentózy stupně III stupně B, jak bylo stanoveno na základě kritérií stanovených v roce 2017 na Světovém workshopu pro klasifikaci parodontálních onemocnění a stavů.

Nechirurgická periodontální léčba byla aplikována do všech kvadrantů u pacientů, kteří se měli zúčastnit studie, za použití periodontálních ručních nástrojů (Gracey kyrety, Hu-Friedy®; Chicago, IL) ve spojení s ultrazvukovým zařízením (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg , Německo). Každý pacient podstoupil první krok nechirurgického parodontálního ošetření, který zahrnoval mechanické odstranění supragingiválních ložisek, motivaci a personalizované pokyny pro ústní hygienu, včetně kontroly mezizubního plaku a čištění zubů pomocí modifikované Bassovy techniky. V prvním týdnu po úvodním sezení byl proveden druhý krok nechirurgické periodontální léčby, která zahrnovala subgingivální instrumentaci (SI), na všech čtyřech kvadrantech v jedné schůzce prováděné stejným zaslepeným operátorem. Pacienti nedostávali žádné předepsané léky ani ústní vodu. Při jednoměsíční následné návštěvě po SI (14 dní před operací) byli pacienti znovu klinicky vyšetřeni a byla znovu posouzena jejich shoda s kritérii pro zařazení/vyloučení. Pacienti vyžadující operaci přístupové chlopně, indikovaní přítomností hlubokých reziduálních kapes (PD ≥ 6 mm), byli identifikováni a podstoupili randomizační proceduru. Různá místa zúčastněných pacientů plánovaná pro parodontální chirurgii byla přiřazena buď jako místa pro přístup k operaci laloku (testovací skupina) nebo neléčená místa (kontrolní skupina) prostřednictvím randomizačního postupu. Další pacienti, u kterých bylo zjištěno, že nepotřebují operaci přístupové chlopně, nebyli do studie zahrnuti a místo toho byli zařazeni do opakovaného subgingiválního instrumentária nebo programu podpůrné periodontální péče.

Během návštěvy byla pacientům přidělena po sobě jdoucí vzestupná čísla. Před zahájením studie bylo pořadí léčebných kvadrantů randomizováno zkoušejícím, který se přímo nepodílel na procesu vyšetření nebo léčby, pomocí náhodných sekvencí generovaných počítačovým generátorem náhodných čísel. Skrytí alokace bylo dosaženo pomocí neprůhledných zapečetěných obálek, postupně číslovaných. Na základě tohoto procesu byly zuby na pravém nebo levém místě označeny jako testovací skupina, zatímco zuby na opačném místě byly přiřazeny ke kontrolní skupině. Přidělení zůstalo vyšetřujícímu skryto po celou dobu periodontálního vyšetření a záznamů a obálka byla operátorem otevřena až při první léčebné návštěvě.

Každý pacient, který splnil kritéria studie, podstoupil jedno z následujících: jedna strana úst byla léčena AFS, zatímco kontralaterální kvadranty sloužily jako kontrola. Všechny přístupové operace byly provedeny stejným zaslepeným parodontologem. Po lokální anestezii byla mukoperiostální chlopeň zvednuta a ošetřena mikrochirurgickými nástroji (čepele, skalpel, držák jehly, nůžky a pinzeta, Carl Martin GmbH, Solingen, Německo) v souladu se zjednodušeným technika papilla preservation flap (SPFF). Granulační tkáň připojená k alveolární kosti byla vyříznuta, aby byl zajištěn úplný přístup a optimální viditelnost povrchů kořenů. Kromě toho byla instrumentace prováděna pomocí kombinace ultrazvukových a ručních nástrojů a během operace laloku nebyla provedena žádná úprava alveolární kosti. Následně byla mukoperiostální chlopeň přemístěna a primárně uzavřena proximálními jednoduchými stehy s použitím monofilního šicího materiálu (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Pacienti dostali pooperační doporučení; nebyly však předepsány žádné léky.

Parodontální měření včetně hloubky sondování (PD) (mm), úrovně klinického přilnutí (CAL) (mm), krvácení při sondování (BOP) (±), gingiválního indexu (GI) a indexu plaku (PI) byla hodnocena ve dvou různých časech intervalech kalibrovaným parodontologem, který byl slepý k pokusným místům.20 Tato měření byla prováděna na šesti různých aspektech každého zubu (disto-bukální/labiální, střední-bukální/labiální, mesio-bukální/labiální, disto-lingvální/palatinální, střední-lingvální/palatinální a mezio-lingvální/palatinální) pomocí manuální periodontální sondou (Williams sonda, Hu-Friedy®; Chicago, IL) a byla vypočtena průměrná hodnota. Pro vyhodnocení hojení periodontálních tkání byla zaznamenána podrobná periodontální skóre před a čtyři týdny po operaci přístupové chlopně.

Mezi periodontálními skóre zaznamenanými u každého pacienta byly čtyři zuby (dva pro léčebnou skupinu a dva pro kontrolní skupinu) vykazující nejvyšší skóre (PD ≥6 mm, CAL ≥5 mm) označeny jako donorová místa pro odběr vzorků subgingiválního plaku. Odběr vzorků byl proveden před a jeden měsíc po operaci výzkumným pracovníkem odpovědným za provádění klinických měření. Místa odběru vzorků byla izolována pomocí sterilních bavlněných smotků s následným odstraněním supragingiválního plaku z povrchu zubu. Následně byly sterilizované papírové hroty (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraiba do Sul, RJ, Brazílie) jemně vloženy do určených periodontálních váčků a vyvíjely jemný tlak, dokud nenarazily na mírný odpor. Papírové hroty byly ponechány v periodontální kapse po dobu 20 sekund, než byly opatrně přeneseny do sterilních mikrocentrifugačních zkumavek, bezpečně uzavřených pro skladování. Vzorky byly uloženy v mrazáku -80 °C v aplikačním centru technologického výzkumu a vývoje Trakya University.

Molekulárně genetická identifikace a kvantifikace subgingiválních periodontopatogenů byly prováděny operátorem, který byl zaslepený vůči skupinové distribuci. Pro izolaci DNA byla použita sada PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, USA). Vzorky v 1,5 ml centrifugačních zkumavkách byly po vyjmutí z -80 °C mrazáku rozmraženy při teplotě místnosti pro rozpuštění. Izolace DNA probíhala podle instrukcí výrobce, zahrnující postupné kroky buněčné lýzy, vazby DNA na filtrační membrány, promytí a eluce. Následně byly zkumavky obsahující vzorky centrifugovány při 21 300 x g po dobu 1 minuty, aby byla získána čistá genomová DNA mikroorganismů. Tyto izolované vzorky DNA byly uchovány při -20 °C až do fáze PCR.

V rámci metodologie kvantitativní PCR v reálném čase byly použity sondy TaqMan® (Applied Biosystems™, CA, USA) značené fluorochromy (fluorescenční látky) na 5' a 3' konci. TaqMan Multiplex Master kit je pohodlnou předsměsí všech složek nezbytných, kromě primerů a sond, k provedení qPCR. Obsahuje DNA polymerázu, dNTP (adenosintrifosfát, guanosintrifosfát, thymidintrifosfát, cytidintrifosfát), KCL nebo MgCL2 a polymerázový pufr. Účelem této technologie je kvalitativně i kvantitativně detekovat známé sekvence genomové, plasmidové nebo komplementární DNA (cDNA).

Pro PCR analýzy bylo 20 ul master mixu (Applied Biosystems™, CA, USA) umístěno do 96jamkových mikrodestičky. Poté bylo do některých z těchto jamek přidáno 5 μl vzorku DNA odebraného z každého případu, aby sloužil jako test, zatímco 5 μl vzorku odebraného od 3 zdravých pacientů, kteří nebyli zahrnuti do studie, bylo přidáno do zbývajících jamek. studny, které mají sloužit jako vnitřní kontrola. Tyto směsi, každá o celkovém objemu 25 μl, byly spuštěny na zařízení PCR (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, CA, USA) Protokol studie qPCR zahrnoval následující kroky: krok aktivace polymerázy ( 1 cyklus při 95 °C po dobu 3 minut), denaturační krok (40 cyklů při 95 °C po dobu 15 s) a krok žíhání/prodlužování (40 cyklů při 5 °C po dobu 30 s).

V kontextu metody qPCR odpovídá zvýšení počtu cyklů současnému zvýšení množství DNA detekované fluorescenčním barvivem. Prahová hodnota cyklu (Ct) se týká počtu cyklu, při kterém fluorescenční záření během amplifikace překročí předem stanovený práh. V této studii byly hodnoty Ct získané z výsledků analýzy vzorků subgingiválního plaku integrovány do vzorce 2-ACt, aby se vypočítal rozdíl v násobku změny vyskytující se v množství mikroorganismů. Rozdíl mezi cílovými bakteriemi detekovanými na začátku a na začátku 1. měsíc byl vypočítán pomocí následujícího vzorce:

ΔCt: [Ct_cílové bakterie v 1. měsíci] - [Ct_cílové bakterie ve výchozím stavu] Násobná změna množství cílových bakterií v 1. měsíci ve srovnání s výchozí hodnotou: 2-Δ∆Ct Všechny analýzy byly provedeny pomocí softwarového balíku SPSS verze 23 (IBM Corp, Armonk, NY). Dvě skupiny, test a kontrola, byly definovány s podstatným rozdílem velikosti účinku (0,4) v mikrobiálních množstvích a hladinou významnosti 0,05. Pro posouzení korelací v opakovaných měřeních s korelačním koeficientem 0,5 byla pomocí softwaru G*Power 3.1.9.2 stanovena velikost vzorku 40 případů (20 testů - 20 kontrol). Hladina významnosti byla stanovena na p < 0,05.

Spojité proměnné byly hodnoceny na normalitu pomocí Shapiro-Wilkova testu. Následně, na základě předpokladu normální distribuce, byla provedena srovnání mezi nezávislými skupinami pomocí buď Studentova t-testu nebo Mann-Whitneyho U testu. Pro srovnání mezi závislými skupinami byly v analýzách použity buď párový t-test, nebo Wilcoxonův test.

Korelace mezi spojitými proměnnými byla zkoumána pomocí Spearmanovy korelační analýzy. Spojité proměnné byly popsány jako průměr ± standardní odchylka (SD), medián (interkvartilní rozpětí (IQR)) a rozpětí (minimum-maximum), zatímco kategorické proměnné byly reprezentovány frekvencí a procentem.