Effekten av tilgangsklaffkirurgi på subgingival peridontopatgogener hos personer med periodontitt

Deltakerne i denne studien var individer diagnostisert med stadium III grad B periodontitt, som bestemt av kriteriene fastsatt i 2017 World Workshop for Classification of Periodontal Diseases and Conditions.

Ikke-kirurgisk periodontal behandling ble gitt til alle kvadranter hos pasienter som skulle delta i studien, ved bruk av periodontale håndinstrumenter (Gracey curettes, Hu-Friedy®; Chicago, IL) i forbindelse med en ultralydenhet (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg , Tyskland). Hver pasient gjennomgikk det første trinnet av ikke-kirurgisk periodontal behandling, som innebar mekanisk fjerning av supragingivale avleiringer, motivasjon og personlige munnhygieneinstruksjoner, inkludert interdental plakkkontroll og tannbørsting ved bruk av den modifiserte Bass-teknikken. I den første uken etter den første økten, ble det andre trinnet i den ikke-kirurgiske periodontale behandlingen, som omfattet subgingival instrumentering (SI), utført på alle fire kvadrantene i en enkelt avtale administrert av den samme blindede operatøren. Pasientene fikk ingen foreskrevet medisin eller munnvann. Ved det ene måneds oppfølgingsbesøket etter SI (14 dager før operasjon) ble pasientene undersøkt klinisk på nytt, og deres overholdelse av inklusjons-/eksklusjonskriteriene ble revurdert. Pasienter som trengte tilgangsklaffkirurgi, indikert ved tilstedeværelse av dype gjenværende lommer (PD ≥ 6 mm), ble identifisert og gjennomgikk randomiseringsprosedyren. Ulike steder for deltakende pasienter som var planlagt for periodontal kirurgi, ble tildelt enten tilgangsklaffoperasjonssteder (testgruppe) eller ubehandlede steder (kontrollgruppe) gjennom en randomiseringsprosedyre. Andre pasienter som ble fastslått å ikke trenge tilgangsklaffkirurgi ble ikke inkludert i studien og ble i stedet registrert i gjentatt subgingival instrumentering eller et støttende periodontalbehandlingsprogram.

Pasientene ble tildelt fortløpende stigende nummer under påmeldingsbesøket. Før studiestart ble rekkefølgen av behandlingskvadranter randomisert av en etterforsker som ikke var direkte involvert i undersøkelsen eller behandlingsprosessen, ved å bruke tilfeldige sekvenser generert av en datamaskin tilfeldig tallgenerator. Tildelingsskjul ble oppnådd ved å bruke ugjennomsiktige forseglede konvolutter, sekvensielt nummererte. Basert på denne prosessen ble tennene på høyre eller venstre sted utpekt som testgruppe, mens de på motsatt sted ble tildelt kontrollgruppen. Tildelingen forble skjult for undersøkeren under hele periodontale undersøkelse og opptak, og konvolutten ble ikke åpnet av operatøren før ved første behandlingsbesøk.

Hver pasient som oppfylte studiekriteriene gjennomgikk ett av følgende: den ene siden av munnen ble behandlet med AFS, mens de kontralaterale kvadrantene fungerte som kontroll. Alle tilgangsoperasjonene ble utført av den samme blindede periodontisten Etter lokalbedøvelse ble mucoperiosteal klaff hevet og håndtert med mikrokirurgiske instrumenter (blader, skalpell, nåleholder, saks og pinsett, Carl Martin GmbH, Solingen, Tyskland) i samsvar med den forenklede papilla preservation flap (SPFF) teknikk. Granulasjonsvev festet til alveolarbenet ble skåret ut for å sikre fullstendig tilgang og optimal synlighet av rotoverflatene. I tillegg ble instrumentering utført ved bruk av en kombinasjon av ultralyd- og håndinstrumenter, og ingen alveolær benmodifikasjon ble foretatt under klaffprosedyren. Deretter ble mucoperiosteal klaffen reposisjonert og primært lukket med proksimale enkle suturer ved bruk av monofilament suturmateriale (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Pasientene ble gitt postoperative anbefalinger; men ingen medisiner ble foreskrevet.

Periodontale målinger inkludert sonderingsdybde (PD) (mm), klinisk festenivå (CAL) (mm), blødning ved sondering (BOP) (±), gingivalindeks (GI) og plakkindeks (PI) ble vurdert på to forskjellige tidspunkter intervaller av en kalibrert periodontist som ble blindet for forsøksstedene.20 Disse målingene ble utført på seks forskjellige aspekter av hver tann (disto-bukkal/labial, mid-bukcal/labial, mesio-bukcal/labial, disto-lingual/palatinal, midlingual/palatinal og mesiolingual/palatinal) ved å bruke en manuell periodontal probe (Williams probe, Hu-Friedy®; Chicago, IL), og gjennomsnittsverdien ble beregnet. For å evaluere tilheling av periodontalt vev, ble detaljerte periodontale skårer registrert før og fire uker etter kirurgi med tilgangsklaff.

Blant de periodontale skårene som ble registrert for hver pasient, ble fire tenner (to for behandlingsgruppen og to for kontrollgruppen) som viste de høyeste skårene (PD ≥6 mm, CAL ≥5 mm) utpekt som donorsteder for subgingival plakkprøvetaking. Prøveinnsamling ble utført før og en måned etter operasjonen av etterforskeren som var ansvarlig for å utføre kliniske målinger. Prøvetakingssteder ble isolert ved bruk av sterile bomullsruller, etterfulgt av supragingival plakkfjerning fra tannoverflaten. Deretter ble steriliserte papirpunkter (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraiba do Sul, RJ, Brasil) skånsomt satt inn i de angitte periodontale lommene, med et forsiktig trykk inntil de møtte mild motstand. Papirpunktene ble holdt inne i den periodontale lommen i 20 sekunder før de ble forsiktig overført til sterile mikrosentrifugerør, forsvarlig lukket for lagring. Prøvene ble lagret i en -80°C fryser ved Trakya University Technology Research and Development Application Center.

Den molekylærgenetiske identifiseringen og kvantifiseringen av subgingivale periodontopatogener ble utført av en operatør som var blindet for gruppedistribusjon. PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, USA) ble brukt for DNA-isolering. Prøver i 1,5 ml sentrifugerør ble tint ved romtemperatur for oppløsning etter å ha blitt hentet fra -80°C fryseren. DNA-isolering foregikk i henhold til produsentens instruksjoner, inkludert sekvensielle trinn med cellelyse, DNA-binding til filtermembraner, vasking og eluering. Deretter gjennomgikk rørene som inneholdt prøvene sentrifugering ved 21 300 x g i 1 minutt for å skaffe rent genomisk DNA fra mikroorganismer. Disse isolerte DNA-prøvene ble bevart ved -20˚C frem til PCR-stadiet.

Innenfor sanntids kvantitativ PCR-metodikk ble TaqMan®-prober (Applied Biosystems™, CA, USA) merket med fluorokromer (fluorescerende stoffer) ved 5'- og 3'-terminalene brukt. TaqMan Multiplex Master-settet er en praktisk forhåndsblanding av alle nødvendige komponenter, bortsett fra primere og prober, for å utføre qPCR. Den inneholder DNA-polymerase, dNTP-er (adenosintrifosfat, guanosintrifosfat, tymidintrifosfat, cytidintrifosfat), KCL eller MgCL2 og polymerasebuffer. Formålet med denne teknologien er å oppdage kjente genomiske, plasmid- eller komplementære DNA (cDNA)-sekvenser både kvalitativt og kvantitativt.

For PCR-analyser ble 20 μl masterblanding (Applied Biosystems™, CA, USA) plassert i 96-brønners mikroplater. Deretter ble 5 μl av DNA-prøven tatt fra hvert tilfelle tilsatt noen av disse brønnene for å tjene som en test, mens 5 μl av prøven tatt fra 3 friske pasienter, som ikke var inkludert i studien, ble lagt til de resterende brønner skal tjene som internkontroll. Disse blandingene, hver med et totalt volum på 25 μL, ble kjørt på PCR-maskinen (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, CA, USA) qPCR-studieprotokollen inkluderte følgende trinn: et polymeraseaktiveringstrinn ( 1 syklus ved 95 °C i 3 minutter), et denatureringstrinn (40 sykluser ved 95 °C i 15 s), og et annealing/forlengelsestrinn (40 sykluser ved 5 °C i 30 s).

I sammenheng med qPCR-metoden tilsvarer en økning i antall sykluser en samtidig økning i mengden DNA som oppdages av det fluorescerende fargestoffet. Terskelsyklusverdien (Ct) refererer til syklusnummeret der fluorescensstrålingen overgår en forhåndsbestemt terskel under amplifikasjon. I denne studien ble Ct-verdiene oppnådd fra analyseresultatene fra subgingivale plakkprøver integrert i 2-ΔCt-formelen for å beregne forskjellen i foldendring som oppstår i mengdene av mikroorganismer. Forskjellen mellom målbakteriene som ble oppdaget ved baseline og på den første måneden ble beregnet ved å bruke følgende formel:

ΔCt: [Ct_target bacteria in 1st month] - [Ct_target bacteria in baseline] Gangendring i mengder av målbakterier på 1. måned sammenlignet med baseline: 2-Δ∆Ct Alle analyser ble utført ved bruk av SPSS versjon 23-programvarepakken (IBM) Corp, Armonk, NY). To grupper, test og kontroll, ble definert med en betydelig effektstørrelse (0,4) forskjell i mikrobielle mengder og et signifikansnivå på 0,05. For å vurdere korrelasjoner i gjentatte målinger med en korrelasjonskoeffisient på 0,5 ble en prøvestørrelse på 40 tilfeller (20 tester - 20 kontroller) bestemt ved bruk av G*Power 3.1.9.2 programvare. Signifikansnivået ble satt til p < 0,05.

Kontinuerlige variabler ble vurdert for normalitet ved bruk av Shapiro-Wilk-testen. Deretter, basert på normalfordelingsantakelsen, ble sammenligninger mellom uavhengige grupper utført ved bruk av enten Students t-test eller Mann-Whitney U-test. For sammenligninger mellom avhengige grupper brukte analysene enten den parede t-testen eller Wilcoxon-testen.

Korrelasjonen mellom kontinuerlige variabler ble undersøkt gjennom Spearman korrelasjonsanalyse. Kontinuerlige variabler ble beskrevet i form av gjennomsnitt ± standardavvik (SD), median (interkvartilt område (IQR)), og område (minimum-maksimum), mens kategoriske variabler ble representert ved frekvens og prosent.