Effekten af ​​adgangsklapkirurgi på subgingival peridontopatgogener hos personer med paradentose

Deltagerne i denne undersøgelse var individer diagnosticeret med fase III grad B paradentose, som bestemt af kriterierne fastlagt i 2017 World Workshop for Classification of Periodontal Diseases and Conditions.

Ikke-kirurgisk parodontal behandling blev givet til alle kvadranter hos patienter, der var planlagt til at deltage i undersøgelsen, ved hjælp af parodontale håndinstrumenter (Gracey curettes, Hu-Friedy®; Chicago, IL) i forbindelse med en ultralydsanordning (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg) , Tyskland). Hver patient gennemgik det første trin af ikke-kirurgisk parodontal behandling, som involverede mekanisk fjernelse af supragingivale aflejringer, motivation og personlige mundhygiejneinstruktioner, inklusive interdental plakkontrol og tandbørstning ved hjælp af den modificerede Bass-teknik. I den første uge efter den indledende session blev det andet trin af den ikke-kirurgiske parodontale behandling, som omfattede subgingival instrumentering (SI), udført på alle fire kvadranter i en enkelt aftale administreret af den samme blindede operatør. Patienterne modtog ingen ordineret medicin eller mundskyl. Ved det en-måneders opfølgningsbesøg efter SI (14 dage før operationen) blev patienterne klinisk genundersøgt, og deres overholdelse af inklusions-/eksklusionskriterierne blev revurderet. Patienter, der havde behov for operation med adgangsklap, indikeret ved tilstedeværelsen af ​​dybe resterende lommer (PD ≥ 6 mm), blev identificeret og gennemgik randomiseringsproceduren. Forskellige steder for deltagende patienter, der var planlagt til parodontal kirurgi, blev tildelt som enten adgangsklapoperationssteder (testgruppe) eller ubehandlede steder (kontrolgruppe) gennem en randomiseringsprocedure. Andre patienter, der var fast besluttet på ikke at have behov for kirurgi med adgangsklap, blev ikke inkluderet i undersøgelsen og blev i stedet indskrevet i gentagen subgingival instrumentering eller et understøttende parodontal plejeprogram.

Patienterne blev tildelt fortløbende stigende numre under tilmeldingsbesøget. Forud for påbegyndelsen af ​​undersøgelsen blev rækkefølgen af ​​behandlingskvadranter randomiseret af en efterforsker, der ikke var direkte involveret i undersøgelsen eller behandlingsprocessen, ved hjælp af tilfældige sekvenser genereret af en computer tilfældigt tal generator. Tildelingsskjul blev opnået ved hjælp af uigennemsigtige forseglede konvolutter, sekventielt nummererede. Baseret på denne proces blev tænderne på højre eller venstre sted udpeget som testgruppen, mens tænderne på det modsatte sted blev tildelt kontrolgruppen. Tildelingen forblev skjult for undersøgeren under hele parodontale undersøgelse og optagelser, og kuverten blev først åbnet af operatøren ved første behandlingsbesøg.

Hver patient, der opfyldte undersøgelseskriterierne, gennemgik et af følgende: den ene side af munden blev behandlet med AFS, mens de kontralaterale kvadranter fungerede som kontrol. Alle adgangsoperationer blev udført af den samme blindede parodontist Efter lokalbedøvelse blev mucoperiosteal flap forhøjet og håndteret med mikrokirurgiske instrumenter (blade, skalpel, nåleholder, saks og pincet, Carl Martin GmbH, Solingen, Tyskland) i overensstemmelse med den forenklede papilla konserveringsflap (SPFF) teknik. Granulationsvæv knyttet til den alveolære knogle blev skåret ud for at sikre fuldstændig adgang og optimal synlighed af rodoverfladerne. Derudover blev instrumentering udført ved hjælp af en kombination af ultralyds- og håndinstrumenter, og der blev ikke foretaget nogen alveolær knoglemodifikation under flapproceduren. Efterfølgende blev den mucoperiosteale flap genplaceret og primært lukket med proksimale simple suturer under anvendelse af monofilament suturmateriale (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Patienterne fik postoperative anbefalinger; dog blev der ikke ordineret nogen medicin.

Periodontale målinger inklusive sonderingsdybde (PD) (mm), klinisk tilknytningsniveau (CAL) (mm), blødning ved sondering (BOP) (±), gingivalindeks (GI) og plakindeks (PI) blev vurderet på to forskellige tidspunkter intervaller af en kalibreret parodontist, der blev blindet til forsøgsstederne.20 Disse målinger blev udført på seks forskellige aspekter af hver tand (disto-bukkal/labial, mid-bukkal/labial, mesio-bukkal/labial, disto-lingual/palatinal, mellemlingual/palatinal og mesiolingual/palatinal) vha. en manuel parodontal probe (Williams probe, Hu-Friedy®; Chicago, IL), og den gennemsnitlige værdi blev beregnet. For at evaluere helingen af ​​parodontale væv blev detaljerede parodontale scores registreret før og fire uger efter operation med adgangsklap.

Blandt de parodontale scorer, der blev registreret for hver patient, blev fire tænder (to for behandlingsgruppen og to for kontrolgruppen), der viser den højeste score (PD ≥6 mm, CAL ≥5 mm), udpeget som donorsteder for subgingival plakprøvetagning. Prøveindsamling blev udført før og en måned efter operationen af ​​den investigator, der var ansvarlig for at udføre kliniske målinger. Prøveudtagningssteder blev isoleret under anvendelse af sterile bomuldsruller efterfulgt af supragingival plakfjernelse fra tandoverfladen. Efterfølgende blev steriliserede papirpunkter (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraiba do Sul, RJ, Brasilien) skånsomt indsat i de udpegede parodontale lommer, idet de udøvede et blidt tryk, indtil de stødte på mild modstand. Papirpunkterne blev tilbageholdt i parodontallommen i 20 sekunder, før de forsigtigt blev overført til sterile mikrocentrifugerør med forsvarligt låg til opbevaring. Prøverne blev opbevaret i en -80°C fryser på Trakya University Technology Research and Development Application Center.

Den molekylærgenetiske identifikation og kvantificering af subgingivale periodontopatogener blev udført af en operatør, der var blindet for gruppefordeling. PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, USA) blev anvendt til DNA-isolering. Prøver i 1,5 ml centrifugerør blev optøet ved stuetemperatur til opløsning efter at være blevet hentet fra -80°C fryseren. DNA-isolering foregik i overensstemmelse med producentens instruktioner, hvilket involverede sekventielle trin af cellelyse, DNA-binding til filtermembraner, vask og eluering. Efterfølgende gennemgik rørene, der indeholdt prøverne, centrifugering ved 21.300 x g i 1 minut for at fremskaffe rent genomisk DNA fra mikroorganismer. Disse isolerede DNA-prøver blev bevaret ved -20˚C indtil PCR-stadiet.

Inden for real-time kvantitative PCR-metodologien blev TaqMan®-prober (Applied Biosystems™, CA, USA) mærket med fluorochromer (fluorescerende stoffer) ved 5'- og 3'-termini anvendt. TaqMan Multiplex Master kit er en bekvem forblanding af alle komponenter, der er nødvendige, bortset fra primere og prober, for at udføre qPCR. Det indeholder DNA-polymerase, dNTP'er (adenosintriphosphat, guanosintriphosphat, thymidintriphosphat, cytidintriphosphat), KCL eller MgCL2 og polymerasebuffer. Formålet med denne teknologi er at detektere kendte genomiske, plasmid- eller komplementære DNA-sekvenser (cDNA) både kvalitativt og kvantitativt.

Til PCR-analyser blev 20 μl mastermix (Applied Biosystems™, CA, USA) anbragt i 96-brønds mikroplader. Derefter blev 5 μl af DNA-prøven taget fra hvert tilfælde tilsat nogle af disse brønde for at tjene som en test, mens 5 μl af prøven taget fra 3 raske patienter, som ikke var inkluderet i undersøgelsen, blev tilføjet til de resterende brønde til at fungere som en intern kontrol. Disse blandinger, hver med et samlet volumen på 25 μL, blev kørt på PCR-maskinen (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, CA, USA) qPCR-undersøgelsesprotokollen omfattede følgende trin: et polymeraseaktiveringstrin ( 1 cyklus ved 95 °C i 3 minutter), et denatureringstrin (40 cyklusser ved 95 °C i 15 s) og en annealing/udvidelsestrin (40 cyklusser ved 5 °C i 30 s).

I forbindelse med qPCR-metoden svarer en stigning i antallet af cyklusser til en samtidig stigning i mængden af ​​DNA påvist af det fluorescerende farvestof. Tærskelcyklusværdien (Ct) refererer til cyklusnummeret, ved hvilket fluorescensstrålingen overstiger en forudbestemt tærskelværdi under amplifikation. I denne undersøgelse blev Ct-værdierne opnået fra analyseresultaterne af subgingivale plaqueprøver integreret i 2-ΔCt-formlen for at beregne forskellen i foldændring, der forekommer i mængderne af mikroorganismer. Forskellen mellem målbakterierne påvist ved baseline og på den 1. måned blev beregnet ved hjælp af følgende formel:

ΔCt: [Ct_target bacteria in 1st month] - [Ct_target bacteria in baseline] Den foldede ændring i mængder af målbakterierne den 1. måned sammenlignet med baseline: 2-Δ∆Ct Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS version 23 softwarepakken (IBM) Corp, Armonk, NY). To grupper, test og kontrol, blev defineret med en væsentlig effektstørrelse (0,4) forskel i mikrobielle mængder og et signifikansniveau på 0,05. For at vurdere korrelationer i gentagne målinger med en korrelationskoefficient på 0,5 blev en stikprøvestørrelse på 40 tilfælde (20 test - 20 kontrol) bestemt ved hjælp af G*Power 3.1.9.2 software. Signifikansniveauet blev sat til p < 0,05.

Kontinuerlige variabler blev vurderet for normalitet ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen. Efterfølgende, baseret på normalfordelingsantagelsen, blev sammenligninger mellem uafhængige grupper udført ved hjælp af enten Students t-test eller Mann-Whitney U-test. Til sammenligninger mellem afhængige grupper anvendte analyserne enten den parrede t-test eller Wilcoxon-testen.

Korrelationen mellem kontinuerte variable blev undersøgt gennem Spearman korrelationsanalyse. Kontinuerlige variabler blev beskrevet i form af middel ± standardafvigelse (SD), median (interkvartilområde (IQR)) og interval (minimum-maksimum), mens kategoriske variable var repræsenteret ved frekvens og procent.