RFC1-アタキシア/キャンバスにおける病原性の洞察とバイオマーカーの検索 (INSIDE-CANVAS)

研究提案は、RFC1-消毒症患者のコホートにおける世界疾患の重症度および/または進行の評価における個々の検証済みの臨床評価尺度の感度を評価および比較する主な目的として認識されています。特にミトコンドリア機能に関して、RFC1-毒性の病因についての洞察を得るため。

これらの目的のために、遺伝的に決定されたRFC1-運動失調患者の研究コホートの縦断的評価（25 ptsを治療する意図）が実施されます。

RFC1-毒性における小脳および固有受容システムの関与に基づいて、以下の臨床評価尺度が選択されています：運動失調（SARA）の評価と評価の尺度、国際協同運動失調症スケール（ICARS）、感覚運動失調症（SEARS）、BERGバランススケール（BBS）、およびチニット評価ツール。 前庭症状は、めまいハンディキャップインベントリアンケート（DHI）によって評価されます。

臨床的重症度に関する統計分析のために、T0（ベースライン）RFC1-患者も受けることになります。

1）神経生理学的研究：EMGおよび神経研究、4つの手足で記録された運動および感覚誘発電位。 2）ビデオヘッドインパルステストによる前庭機能評価。 収集されたデータには、症状の発症年齢（AAO）、登録年齢（AAE）、疾患期間（DD）も含まれます。原因不明の咳や嚥下障害の存在。 3T脳および脊髄MRI。 統計分析は、ピアソンの相関テストによって実行されます。 各スケールのグローバルスコアとアイテムスコアもDD、Spatax障害スコアによって推定される障害段階（0：機能的ハンディキャップなし、1：機能的なハンディキャップなし：1：機能的なハンディキャップなし）と相関します。2：軽度、無制限のウォーキング、3：中程度の、走ることができない、走ることができない、援助なし、4：segress walking waking walk walk waking ain for ain for ain for ain for ain for ain for see anベッド）、および運動障害に個別に寄与するその他の主要な診断所見（すなわち、神経障害、前庭障害、小脳萎縮）。

2番目の目的では、RFC1-運動失調コホートと、酸化ストレス（OS）およびニューロフィラメントライトチェーン（NFL）の循環バイオマーカー（NFL）の循環バイオマーカーのパネル（ベースライン訪問）とT1（1年目のフォローアップ訪問）のパネルの評価のために登録された年齢と性のコホートのコホートから血液サンプルが収集されます。 血液サンプルを処理して、血​​清、血漿、RNAを得ます。 血清分析では、掃除機中の9 ccの血液（CAT血清SEPクロット活性化因子）チューブが描画され、1時間以内に遠心分離され、複数の50 ULアリコートでアリコートされ、-80°Cで保存されます。 血漿分析では、9 ccの血液がEDTAチューブに引き込まれ、室温で30インチ後に遠心分離し、50 ULアリコートでアリコートされ、-80°Cで保存されます。 最後に、静脈血はEDTAを含む1つの10 mL BDバクタイナーチューブに引き込まれ、総RNAは白血球から抽出され、cDNAに逆転写され、-80°Cで保存されます。 収集されたすべてのサンプルは保管され、収集期間の終わりに、外部サービス（ローマのバンビノジェス病院の分子医学の実験室）を使用して、凍結融解サイクルを避けるために同時に出荷および検査されます。 NRF2は、抗酸化防御の活性化、炎症の阻害、ミトコンドリア機能の改善、およびタンパク質恒常性の維持を通じて、多くの細胞保護経路を調節します。 注目すべきことに、この経路の変化は、ミトコンドリア機能障害、特にフリードライヒ運動症に関連する神経変性疾患に関連しています。 抗酸化反応に関連する血清マーカーには、グルタチオンペルオキシダーゼ、還元グルタチオン（GSH）および酸化グルタチオン（GSSG）、およびグルタミルシスタインリガーゼ、グルタチオン、グルタチオン、グタチオン、レンズメティックアサイ、およびゼンツェフルートリンティックアサイとエンツェ類 - 尿網のアサイと測定されたグルタミルシステインリガーゼ）が含まれます。免疫吸着アッセイ（ELISA）。

NFLレベルは、Ella Automated ImmunoAssayによって評価されます。 RFC1患者とコントロールの両方で得られた結果は、Mann Whitney U-Test（WindowsのBM SPSS統計、バージョン24.0によって統計的に比較されます。 ニューヨーク州アーモンク）RFC1患者でバイオマーカーが有意に異なるかどうかをテストするため、潜在的に疾患のバイオマーカーを表す可能性があります。 肯定的な結果の場合、疾患の重症度マーカーとしての役割を評価するために、それらのレベルは、コホートでテストされたものの中で最も敏感である臨床評価尺度のグローバルスコアとアイテムスコアの両方と相関します。 また、T0とT1のレベルは、疾患進行バイオマーカーとしての潜在的な役割を評価するために、Canvas -RFC1患者対対照で比較されます。

別の二次的な目的は、RFC1患者由来線維芽細胞におけるミトコンドリア機能の深い特性評価と、キャンバス患者の組織で実施された将来の研究のための誘導多能性STEM（IPSC）細胞株の確立にあります。関連するOxphosの欠陥はこれまでに実行されていません。 この目的のために、患者およびコントロール由来の原発性線維芽細胞（PF）（8つの異なるRFC1患者と8つの一致した健康なコントロール）が並行して分析されます。 RFC1タンパク質およびmRNAレベルは、細胞溶解物から抽出された総タンパク質とRNAでそれぞれウエスタンブロット（WB）および定量的（Q）PCRを介して定量化され、RFC1タンパク質またはカンバスPTSおよびコントロール間の転写レベルの有意な減少の存在を評価します。

酸化ストレスとミトコンドリア機能に関する研究：研究者の予備データは、ミトコンドリア機能障害がRFC1-アタキシアの病因に役割を果たす可能性があることを支持しています。

この仮説を検証するために、ミトコンドリア機能はRFC1で評価され、さまざまなアプローチによって線維芽細胞を制御します。

i）ミトコンドリア機能障害の存在は、ミトコンドリアのダイナミクス、形態、および超微細構造のいずれかの変化に関連していることがよくあります。 これらの機能は、共焦点および透過型電子顕微鏡（TEM）によって調査されます。 in vivo細胞イメージングの場合、細胞はMitotracker RedおよびHoechst（核プローブ）で染色されます。 次に、A1共焦点顕微鏡を使用して画像がキャプチャされ、特定のソフトウェア（Nikon Instruments）を使用して画像分析が実行されます。 細胞は、糸状、中間、および断片化されたミトコンドリアの3つのカテゴリにスコアリングされます。 ミトコンドリアの超微細構造は、Tecnai G2（FEI）TEMによって超甲状腺機能細胞セクションで分析されます。

ii）ミトコンドリア機能障害は、ミトコン症を活性化する可能性があり、その結果、細胞エネルギーの欠陥に寄与するミトコンドリア質量が減少します。 ミトコンドリア腫瘤は、ミトコンドリア腫瘤の2つのミトコンドリアタンパク質指数であるポリンの免疫ブロットとTom20によって評価されます。 追加のインデックスとして、クエン酸シンターゼ活性の両方、分光光度測定によるミトコンドリアマトリックス酵素、およびQPCRによる総mtDNAコピー数の両方が測定されます。

iii）RFC1細胞における障害のあるオックスフォスプロセスの存在を強調するために、線維芽細胞は、培養培地にガラクトースをグルコースに置き換えることにより、ミトコンドリアのoxphosを使用してATPを合成することを余儀なくされます。 グリコリシスへのガラクトースの侵入は、グルコースよりも大幅に低い速度で発生します。 したがって、RFC1およびコントロール線維芽細胞は、最大72時間の主エネルギー基質としてグルコースまたはガラクトースを含むDMEMで培養され、細胞の成長が分析されます。 オックスフォスを深く調査するために、酸素消費率は、状態4、状態3および非結合呼吸条件、およびオリゴマイシン感受性ATP合成の最大速度の下でのジギトニン透過化細胞（OCR）で測定されます。 さらに、患者の線維芽細胞がエネルギー不足かどうかを明確に確立するために、細胞内ATPレベルが測定されます。 状態4および状態3呼吸速度は、それぞれ飽和ADPの存在下および存在下で測定され、Uncoupler FCCP（Carbonyl syanide-P-Trifluoromethoxyphenylhydrazone）の存在下での共役呼吸が測定されます。 ATP合成速度を駆動した複合体は、上記の3つの呼吸条件の下で測定されます。 細胞の合成されたATPまたは定常状態ATP含有量は、ルミノメトリック法によって定量化されます。

iv）ミトコンドリア機能障害は、ミトコンドリア膜電位（MMP）の変化とROS生産につながります。 したがって、ミトコンドリアの主要な機能パラメーターであるMMPは、ミトコンドリアネットワークと内部ミトコンドリア膜電位Δψmの両方の変化を検出するために、蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーの両方によって細胞で推定されます。 Δψmは、細胞にテトラメチルホダミンメチルエステル（TMRM）をロードすることにより測定されます。これは、Δψm依存的にミトコンドリアに入る親油性プローブです。 細胞は、ATPシンターゼ複合体の特定の阻害剤であるオリゴマイシンの非存在下または存在下で、およびFCCPの下でTMRMとインキュベートされます。 患者とコントロール線維芽細胞の複数の高出力蛍光画像は、IAS2000ソフトウェア（Delta Sistemi、Roma、Italy）を使用して蛍光逆顕微鏡で獲得されます。 フローサイトメトリーによる定量的Δψm分析には、Muse Cell Analyzer（Millipore、Billerica、MA、USA）が流れるようなソフトウェア（Turku大学のBiotechnology Center）を適用して使用されます。 ミトコンドリアの変化の証拠は、オックスフォス複合体の免疫ブロットングv）in vivo評価と並行してさらに対処されます。 Museサイトメーターを使用した、セルロックスオレンジ蛍光プローブによるマイトソックスレッド、およびセルラーROSレベル。 ROSの変化が、細胞の抗酸化防御システムの変化に依存しているかどうか、主要な抗酸化酵素のレベルと活性と総グルタチオンレベルのレベルと活性は、それぞれ免疫ブロットと分光光度アッセイによって評価されます。

vi）RFC1線維芽細胞におけるミトコンドリアの有意な変化の発見は、ミトコンドリア誘発細胞死に対する陽性を調査するように促されます。 ROSの増加は、内部ミトコンドリア膜におけるシクロスポリン感受性細胞の透過性移行を誘導し、ミトコンドリアの腫れとその結果、ATP合成とイオンの両方の恒常性の破壊を引き起こし、細胞死を引き起こします。 アポトーシスの活性化は、異なる時期にグルコース濃縮されたDMEM培地の患者および対照細胞で評価されます。 細胞死の前性は、Muse Count and Viabality Assay Kit、Annexin VおよびDead Cell Assay Kit、およびCaspase-3/7アッセイキットを使用して、Muse Cell Analyzerによって評価されます。

最後の追加の目的として、この研究では、iPSCが確立されます。 3つのRFC1および3つのコントロールPF培養ラインは、J Rosati博士との共同/監督、IRCCS Casa Sollievo Della Sofferenzaとの協力/監督に誘導されます。 これらのiPSCは、感覚ニューロンがRFC1-誘導症患者で常に影響を受けるため、原発性固有受容ニューロンにさらに区別されます。