Insights patogênicos e busca de biomarcadores em rfc1-ataxia/tela (INSIDE-CANVAS)

A proposta de pesquisa reconhece como o objetivo principal de avaliar e comparar a sensibilidade de escalas individuais de classificação clínica validada na avaliação da gravidade e/ou progressão da doença global em uma coorte de pacientes com rfc1-ataxia e ataxia secundária são i) para identificar novos biomarcadores em circulação em rfc1-ataxia, testando um coonhor de cootrat de RF em co-construção de um cootrato de RF. Modelos de células para obter informações sobre a patogênese da RFC1-ataxia, particularmente em relação à função mitocondrial.

Para esses propósitos, será realizada uma avaliação longitudinal de uma coorte de estudo de pacientes com RFC1-ataxia geneticamente determinada (intenção de tratar 25 pontos).

Com base no envolvimento de sistemas cerebelares e proprioceptivos em RFC1-ataxia, foram selecionadas as seguintes escalas de classificação clínica: escala para a avaliação e classificação da ataxia (SARA), a escala de avaliação de ataxia (SARA), a escala de avaliação de bobs. Os sintomas vestibulares serão avaliados pelo Questionário de Inventário de Handicap tontura (DHI).

Para análises estatísticas sobre a gravidade clínica, em T0 (Base) RFC1- Pacientes também serão submetidos a:

1) Estudos neurofisiológicos: estudos EMG e nervos, potenciais evocados motores e sensoriais registrados nos quatro membros; 2) Avaliação da Função Vestibular por teste de imbulência da cabeça em vídeo. Os dados coletados também incluirão: idade no início (AAO) de sintomas, idade na inscrição (AAE), duração da doença (DD); presença de tosse inexplicável e/ou distúrbios de deglutição; 3T Cérebro e ressonância magnética da medula espinhal. A análise estatística será realizada pelos testes de correlação de Pearson. Global and item scores for each scale will be also correlated with DD, disability stage estimated by the SPATAX disability score (0: no functional handicap, 1: no functional handicap but signs at examination, 2: mild, able to run, unlimited walking, 3: moderate, unable to run, limited walking without aid, 4: severe, walking with one stick, 5: walking with two sticks, 6: unable to walk, requiring a wheelchair, 7: confinado a uma cama) e outros achados diagnósticos importantes, contribuindo individualmente para a incapacidade motora (ou seja, neuropatia, vestibulopatia, atrofia cerebelar).

Para o segundo objetivo, as amostras de sangue serão coletadas da coorte RFC1-Ataxia e uma coorte de controles saudáveis ​​de idade e sexo correspondentes a esse fim para a avaliação de um painel de biomarcadores circulantes da tensão oxidativa (OS) e da cadeia leve de neurofilamentos (NFL), na visita T0 (visita de fasel) e T1 (um T1) (um T1) e um seguimento de uma visita ao T1) e T1. Amostras de sangue serão processadas para obter soro, plasma e RNA. Para análises séricas, 9 cc de sangue no tubo de vacute (ativador do coágulo sérico de gato) serão desenhados, centrifugados em 1 hora, aliquitados em várias alíquotas de 50 UL e armazenados a -80 ° C. Para análises de plasma, 9 cc de sangue serão desenhados para os tubos EDTA e, após 30 'à temperatura ambiente, serão centrifugados e aliquitados em 50 UL alíquotas e armazenados a -80 ° C. Por fim, o sangue venoso será desenhado em um tubo de 10 ml de vacutanteador BD com EDTA, e o RNA total será extraído dos leucócitos e transcrito reverso para cDNA, que será armazenado a -80 ° C. Todas as amostras coletadas serão armazenadas; portanto, no final do período de coleta, serão enviadas e examinadas simultaneamente em duplicado para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, usando um serviço externo (laboratório de medicina molecular do fator de transcrição NRFER (Roma). O NRF2 regula muitas vias citoprotetoras através da ativação de defesas antioxidantes, inibição da inflamação, melhora da função mitocondrial e manutenção da homeostase das proteínas. É importante notar que as alterações nessa via foram associadas a doenças neurodegenerativas associadas à disfunção mitocondrial, em particular a ataxia de Friedreich. Serum markers related to antioxidant response include: glutathione peroxidase, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), and glutathione metabolism (gamma-glutamylcysteine ​​ligase, glutathione reductase) measured in sera by spectrophoto-fluorimetric assays and enzyme-linked Ensaio imunossorvente (ELISA).

Os níveis da NFL serão avaliados pela Ella Automatation Immunoensay. Os resultados obtidos em pacientes com RFC1 e controles serão comparados estatisticamente pelo teste U de Mann Whitney (BM SPSS Statistics for Windows, versão 24.0. Armonk, NY) para testar se algum biomarcador seria significativamente diferente em pacientes com RFC1, representando potencialmente um biomarcador de doença. Em caso de resultados positivos, para avaliar o papel como marcador de gravidade da doença, seus níveis serão correlacionados com os escores globais e de itens da escala de classificação clínica sendo os mais sensíveis entre os testados na coorte. Além disso, seus níveis em T0 e T1 serão comparados em pacientes com tela -RFC1 versus controles, para avaliar seu papel potencial como biomarcador de progressão da doença.

Outro objetivo secundário consiste na profunda caracterização da função mitocondrial nos fibroblastos derivados do paciente RFC1 e no estabelecimento de linhas celulares induzidas de tronco pluripotente (iPSC) para pesquisas futuras para estudos anteriores conduzidos em pacientes com m-MATAs e níveis de proteína normais e níveis de transcritos de RFC1, mas estudos em estudos e os estudos e os estudos de m-minerent e os níveis de transcritos normais do RFC1, no entanto, no entanto, no MS. e o defeito de oxphos relacionado não foi realizado até agora. Para esse propósito, os fibroblastos primários derivados de pacientes e controles (PF) (8 pacientes com RFC1 distintos e 8 controles saudáveis ​​correspondentes) serão analisados ​​em paralelo. Os níveis de proteína RFC1 e mRNA serão quantificados através de Western blot (WB) e PCR quantitativa (q), respectivamente, na proteína total e no RNA extraído do lisado celular para avaliar a presença de qualquer redução significativa na proteína RFC1 ou níveis de transcrição entre PTS e controles de tela.

Estudos sobre estresse oxidativo e função mitocondrial: dados preliminares dos investigadores apóiam que a disfunção mitocondrial pode desempenhar um papel na patogênese da ataxia RFC1, pois a microscopia eletrônica revelou a presença de fibrobroastos mitocondrial norma.

Para verificar essa hipótese, a função mitocondrial será avaliada no RFC1 e controla os fibroblastos por diferentes abordagens:

i) A presença de disfunção mitocondrial é frequentemente associada a alterações na dinâmica, morfologia e ultraestrutura de mitocôndrias. Esses recursos serão investigados por microscopia eletrônica confocal e de transmissão (TEM). Para imagens de células in vivo, as células serão coradas com o MitoTracker Red e Hoechst (sonda nuclear). As imagens serão capturadas usando um microscópio confocal A1 e a análise de imagens será executada usando um software específico (Nikon Instruments). As células serão pontuadas em três categorias: mitocôndrias filamentosas, intermediárias e fragmentadas. A ultraestrutura das mitocôndrias será analisada em seções ultrafinas de células fixas por um Tecnai G2 (FEI) TEM.

ii) A disfunção mitocondrial também pode ativar a mitofagia, com consequente diminuição da massa mitocondrial que contribui para o defeito energético celular. A massa mitocondrial será avaliada por imunotransferência da porina e Tom20, duas proteínas mitocondriais Índice de massa mitocondrial. Como índices adicionais, serão medidas ambas as atividades da citrato sintase, uma enzima da matriz mitocondrial, por espectrofotometria e número total de cópias do mtDNA por qPCR.

iii) Para destacar a presença do processo de oxphos prejudicado nas células RFC1, os fibroblastos serão forçados a utilizar oxphos mitocondriais para sintetizar o ATP, substituindo a galactose à glicose em meio de cultura. A entrada de galactose na glicólise ocorre a uma taxa significativamente menor que a glicose. Portanto, os fibroblastos de RFC1 e controle serão cultivados em DMEM contendo glicose ou galactose como substrato energético principal por até 72 h, e o crescimento celular será analisado. Para investigar profundamente o OXPHOS, a taxa de consumo de oxigênio será medida em células permeabilizadas por digitonina (OCR) sob o estado 4, estado 3 e condições respiratórias não lubrificadas e a taxa máxima de síntese de ATP sensível à oligomicina. Além disso, para definitivamente estabelecer se os fibroblastos dos pacientes são deficientes em energia, os níveis intracelulares de ATP serão medidos. As taxas de respiração do Estado 4 e do Estado 3 serão medidas na ausência e na presença de saturação de ADP, respectivamente, e a respiração desacoplada na presença do desacoplador FCCP (carbonil cianeto-p-trifluorometoxifenil-hidrazona). A taxa de síntese de ATP complexa I acionada será medida sob o estado 3 condições respiratórias descritas acima. O ATP sintetizado ou o conteúdo de células ATP de estado estacionário será quantificado por um método luminométrico.

iv) A disfunção mitocondrial leva a alterações em potencial da membrana mitocondrial (MMP) e produção de ERO. Assim, o MMP, um parâmetro funcional principal das mitocôndrias, será estimado nas células por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo para detectar alterações da rede mitocondrial e do potencial de membrana mitocondrial interna Δψm. Δψm será medido por células de carregamento com éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), uma sonda lipofílica que entra nas mitocôndrias de maneira dependente de Δψm. As células serão incubadas com TMRM na ausência ou presença de oligomicina, um inibidor específico do complexo ATP sintase e sob FCCP. Várias imagens de fluorescência de alta potência de pacientes e controles fibroblastos serão adquiridas pelo microscópio invertido de fluorescência usando o software IAS2000 (Delta Sistemi, Roma, Itália). Para análise quantitativa de Δψm por citometria de fluxo, um analisador de células de musa (Millipore, Billerica, MA, EUA) será usado aplicando o software fluido (Centro de Biotecnologia, Universidade de Turku). Any evidence of mitochondrial alterations will be further addressed by immunoblotting of OXPHOS complexes v) in parallel to in vivo assessment, the possible contribution of higher ROS level and consequent cellular oxidative stress in the pathogenesis of RFC1-ataxia will be evaluated in cultured fibroblasts, by measuring anion superoxide radical (O2 • -) mitochondrial levels by the fluorescent probe Mitosox vermelho e o nível de ERO celular pela sonda fluorescente de Orange Cellrox, usando um citômetro de musa. Para explorar se as alterações de ERO dependem de alterações nos sistemas de defesa antioxidante das células, níveis e atividades das principais enzimas antioxidantes e o nível total e reduzido de glutationa serão avaliadas por imunotransferência e ensaios espectrofotométricos, respectivamente.

vi) A descoberta de alterações mitocondriais significativas nos fibroblastos RFC1 solicitará investigar sua propensão à morte celular induzida por mitocondrial. O aumento da ERO induz a transição de permeabilidade dos poros sensíveis à ciclosporina na membrana mitocondrial interna, o que, por sua vez, causa inchaço nas mitocôndrias e consequente ruptura da síntese de ATP e da homeostase de íons, levando à morte celular. A ativação da apoptose será avaliada nas células do paciente e de controle no meio DMEM enriquecido com glicose em momentos diferentes. A propensão à morte celular será avaliada pelo analisador de células do Muse, usando o kit de ensaio de contagem e viabilidade do Muse e kit de ensaio de anexina V e de células mortas e kit de ensaio Caspase-3/7.

Como último objetivo adicional, neste estudo, os iPSCs serão estabelecidos. Três linhas de cultura RFC1 e três controles serão induzidas em iPSCs, em colaboração/supervisão com o Dr. J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza. Esses iPSC serão ainda mais diferenciados em neurônios proprietários primários, pois os neurônios sensoriais resultam invariavelmente afetados em pacientes com RFC1-ataxia.