Patogenní poznatky a hledání biomarkerů v RFC1-Ataxii/plátně (INSIDE-CANVAS)

The research proposal recognizes as the primary aim to evaluate and compare the sensitivity of individual validated clinical rating scales in assessing global disease severity and/or progression in a cohort of RFC1-ataxia patients Secondary aims are i) to identify novel potential circulating biomarkers in RFC1-ataxia by testing a cohort of RFC1-ataxia patients vs controls and ii) to establish and study patient-derived cell models Chcete-li získat vhled do patogeneze RFC1-ataxie, zejména o mitochondriální funkci.

Pro tyto účely bude provedeno podélné posouzení studijní kohorty geneticky stanovené pacienty s RFC1-ataxií (záměr léčit 25 bodů).

Na základě zapojení cerebelárních a proprioceptivních systémů v Ataxii RFC1 byly vybrány následující stupnice klinického hodnocení: měřítko pro hodnocení a hodnocení ataxie (SARA), měřítko mezinárodního spolupracovního hodnocení ataxie (ICAR), měřítko hodnocení BB (BBS), BBS), BBS), BBS (BBS), měřítko BBS (BBS), BBS), měřítko BBS) a BBS), BBS), měřítko ataxie. Vestibulární symptomy budou hodnoceny dotazníkem Inventory Inventory Inventory Dizziness Handicap (DHI).

Pro statistickou analýzu týkající se klinické závažnosti bude také u pacientů s T0 (základní linií) RFC1- také:

1) Neurofyziologické studie: Studie EMG a nervů, motorické a smyslové evokované potenciály zaznamenané na čtyřech končetinách; 2) Hodnocení vestibulárních funkcí pomocí testu videa hlavy. Shromážděná data budou také zahrnovat: věk při nástupu (AAO) symptomů, věk při zápisu (AAE), doba trvání nemoci (DD); přítomnost nevysvětlitelných kašel a/nebo polykání; 3t mozek a MRI míchy. Statistická analýza bude provádět Pearsonovy korelační testy. Global and item scores for each scale will be also correlated with DD, disability stage estimated by the SPATAX disability score (0: no functional handicap, 1: no functional handicap but signs at examination, 2: mild, able to run, unlimited walking, 3: moderate, unable to run, limited walking without aid, 4: severe, walking with one stick, 5: walking with two sticks, 6: unable to walk, requiring a wheelchair, 7: omezeno na lůžko) a další hlavní diagnostické nálezy individuálně přispívající k motorovému postižení (tj. Neuropatie, vestibulopatie, cerebelární atrofie).

Pro druhý cíl budou odebrány vzorky krve z kohorty RFC1-ataxie a kohorta věku a pohlaví odpovídala zdravé kontrole zapsané k tomuto účelu pro posouzení panelu cirkulujícího biomarkerů oxidačního stresu (OS) a neurofilamentového lehkého řetězce (NFL) (NFL), a při návštěvě T1). Vzorky krve budou zpracovány pro získání séra, plazmy a RNA. Pro analýzy v séru bude nakresleno 9 cc krve ve vakuety (CAT Serum SEP CLOT Activator), odstředěno do 1 hodiny, alikvováno v více 50 alikvotech UL a uloženo při -80 ° C. U plazmatických analýz bude do trubic EDTA vloženo 9 ccm krve a po 30 'při teplotě místnosti bude odstředěno a alikvováno v 50 alikvotech UL a uloženo při -80 ° C. A konečně, žilní krev bude vložena do jedné 10 ml BD Vacutainerovy trubice s EDTA a celková RNA bude extrahována z leukocytů a reverzní přepisováno do cDNA, která bude uložena při -80 ° C. Všechny shromážděné vzorky budou uloženy, poté, na konci období sběru, budou odeslány a prozkoumány současně duplikátem, aby se zabránilo zmrazení-thilaw cyklů pomocí externí služby (laboratoř molekulární medicíny Bambino Gesù Hospital, Rome), bude oxidační stresový panel NRF2 (nukleární faktor erythroid faktoru 2), reálným faktorem 2), reálným faktorem 2), reálným faktorem 2) reálným faktorem 2) reálným faktorem 2) s reálným časovým faktorem 2) reálným faktorem 2) reálným faktorem 2) reálným faktorem 2), který je reálným faktorem. NRF2 reguluje mnoho cytoprotektivních drah aktivací antioxidační obrany, inhibice zánětu, zlepšení mitochondriální funkce a udržování homeostázy proteinů. Je třeba poznamenat, že změny v této dráze byly spojeny s neurodegenerativními chorobami spojenými s mitochondriální dysfunkcí, zejména Friedreich ataxie. Mezi markery séra související s antioxidantovou odpovědí patří: glutathion peroxidáza, redukovaný glutathion (GSH) a oxidovaný glutathion (GSSG) a metabolismus glutathionu (gama-glutamylcystein ligáza, reduktáza glutathionu) měřenými spektrofoto-fluorimetrickou amsays a enzymos-ligázou-ligázou-ligázou). (Elisa).

Hladiny NFL budou hodnoceny pomocí Elly Automatizovaní imunoanalýza. Výsledky získané u pacientů s RFC1 i kontroly budou statisticky porovnány pomocí Mann Whitney U-test (BM SPSS Statistics for Windows, verze 24.0. Armonk, NY) pro testování, zda by se u pacientů s RFC1 výrazně lišily nějaké biomarkery, což potenciálně představuje biomarker nemoci. V případě pozitivních výsledků bude pro posouzení role jako markeru závažnosti onemocnění korelovat jejich hladiny s globálním i položkovým skóre stupnice klinického hodnocení, která je nejcitlivější mezi těmi, které byly testovány v kohortě. Rovněž jejich hladiny v T0 a T1 budou porovnány u pacientů s plátně -RFC1 vs. kontrolami pro vyhodnocení jejich potenciální role jako biomarkeru progrese onemocnění.

Další sekundární cíl spočívá v hluboké charakterizaci mitochondriální funkce ve fibroblastech odvozených od pacienta RFC1 a zavedení indukovaných pluripotentních kmenových (IPSC) buněčných linií pro budoucí výzkum předchozí studie prováděné na tkáních pacientů s plátno a/ opravné a/ opravné prokázaly/ opravny a/ opravny a/ opravny/ opravny) avšak na replikaci rfc1 (replikace mtDNA a opravny) však ve studiích v domněle rfc1 (replikace rfc1 (montáž na plátno a/ opravna) a/ oprava) a/ oprava) a/ oprava) a/ oprava) a// oprava) a// oprava) a// opravna. a související defekt Oxphos dosud nebyl proveden. Za tímto účelem budou paralelně analyzovány primární fibroblasty odvozené od pacientů a kontrol (PF) (8 odlišných pacientů s RFC1 a 8 zdravých kontrol). Hladiny proteinu RFC1 a mRNA budou kvantifikovány prostřednictvím Western blot (WB) a kvantitativních (Q) PCR, respektive na celkovém proteinu a RNA extrahované z buněčného lyzátu, aby se posoudila přítomnost jakéhokoli významného snížení proteinu RFC1 nebo transkripčních hladin mezi Canvas PT a kontrolami.

Studie oxidativního stresu a mitochondriální funkce: Předběžné údaje vyšetřovatelů podporují, že mitochondriální dysfunkce by mohla hrát roli v patogenezi RFC1-ataxie, protože elektronová mikroskopie odhalila přítomnost jasných mitochondriálních abnormalit v RFC1 (dvě odlišné buněčné linie).

Pro ověření této hypotézy bude mitochondriální funkce hodnocena v RFC1 a kontroluje fibroblasty různými přístupy:

i) Přítomnost mitochondriální dysfunkce je často spojena se změnami buď v dynamice, morfologii a ultrastruktuře mitochondrií. Tyto vlastnosti budou zkoumány konfokální a přenosovou elektronovou mikroskopií (TEM). Pro zobrazení buněk in vivo budou buňky obarveny mitotracker červenou a Hoechst (jaderná sonda). Obrázky budou poté zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu A1 a analýza obrázků bude provedena pomocí konkrétního softwaru (Nikon Instruments). Buňky budou hodnoceny do tří kategorií: vláknité, střední a fragmentované mitochondrie. Ultrastruktura mitochondrie bude analyzována na ultratentových pevných buňkách řezy Tecnai G2 (FEI) TEM.

ii) Mitochondriální dysfunkce může také aktivovat mitofagii, s následným snížením mitochondriální hmoty přispívající k defektu buněčné energie. Mitochondriální hmota bude hodnocena imunoblotem porinu a Tom20, dva mitochondriální proteiny index mitochondriální hmoty. Jako další indexy budou měřeny jak aktivita citrátové syntázy, enzym mitochondriální matrice, spektrofotometrií a celkový počet kopií mtDNA pomocí qPCR.

iii) Pro zvýraznění přítomnosti narušeného procesu Oxphos v buňkách RFC1 budou fibroblasty nuceny využívat mitochondriální oxfos k syntetizaci ATP nahrazením galaktózy na glukózu v kultivačním médiu. Vstup galaktózy do glykolýzy se vyskytuje výrazně nižší rychlostí než glukóza. Takže RFC1 a kontrolní fibroblasty budou kultivovány v DMEM obsahujícím glukózu nebo galaktózu jako hlavní energetický substrát po dobu až 72 hodin a bude analyzován růst buněk. K hlubokému zkoumání Oxphos bude míra spotřeby kyslíku měřena v buňkách digitonin-permeabilizovaných (OCR) ve stavu 4, stavu 3 a odpojených respiračních podmínek a maximální rychlosti syntézy ATP citlivé na oligomycin. Kromě toho určitě zjistí, zda jsou fibroblasty pacientů s energií nedostatečné, budou měřeny intracelulární hladiny ATP. Stav 4 a rychlost dýchání stavu 3 budou měřeny v nepřítomnosti a v přítomnosti nasycení ADP, respektive, a odpojeného dýchání v přítomnosti odpojení FCCP (karbonyl kyanid-p-trifluormethoxyfenylhydrazon). Rychlost syntézy ATP poháněná komplexem bude měřena za výše popsaných stavů 3 dýchacích podmínek. Syntetizovaný obsah ATP nebo v ustáleném stavu v buňkách bude kvantifikován luminometrickou metodou.

iv) Mitochondriální dysfunkce vede ke změnám mitochondriálního membránového potenciálu (MMP) a produkci ROS. MMP, hlavní funkční parametr mitochondrií, bude tedy v buňkách odhadnut fluorescenční mikroskopií a průtokovou cytometrií k detekci změn mitochondriální sítě a vnitřního mitochondriálního membránového potenciálu Am. ΔψM bude měřen nakládáním buněk tetramethylrhodaminovým methylesterem (TMRM), lipofilní sondou, která vstupuje do mitochondrie způsobem závislým na A. Buňky budou inkubovány s TMRM buď v nepřítomnosti nebo přítomnosti oligomycinu, specifického inhibitoru komplexu ATP syntázy a pod FCCP. Fluorescenční invertovaný mikroskop pomocí softwaru IAS2000 (Delta Sistemi, Roma, Itálie) získává více vysoce výkonných fluorescenčních obrazů pacientů a kontrolních fibroblastů. Pro kvantitativní analýzu ΔψM pomocí průtokové cytometrie se použije analyzátor muzebních buněk (Millipore, Billerica, MA, USA), který používá tekoucí software (Centrum pro biotechnologii, University of Turku). Jakýkoli důkaz o mitochondriálních změnách bude dále řešen imunoblotováním komplexů Oxphos v) paralelně s hodnocením in vivo, možný příspěvek vyšší hladiny ROS a následná buněčná oxidační stres v patogenezi RFC1 -Ataxie bude hodnocena v kultivovaných fibroblastech fibroblasty podle fluoresových pobastu podle fluoresových pobaxie pomocí fluoresových pobaxie podle fluoresových pobastií podle fluoresových pobaxie podle fluoresových pobaxie pomocí fluoresových pobaxie pomocí fluoresových pobaxie pomocí fluoresových pobaxie. MITOSOX RED a buněčná hladina ROS pomocí oranžové fluorescenční sondy Celrox s použitím cytometru Muse. Pro prozkoumání, zda změny ROS závisí na změnách v antioxidačních obranných systémech buněk, hladin a aktivity hlavních antioxidačních enzymů a celkové a snížené hladiny glutathionu, budou hodnoceny imunoblot a spektrofotometrickými testy.

vi) Zjištění významných mitochondriálních změn ve fibroblastech RFC1 bude vyvolávat prozkoumání jejich pronebosti k mitochondriální buněčné smrti. Zvýšená ROS indukuje přechod pro permeabilitu póru citlivého na cyklosporin ve vnitřní mitochondriální membráně, což zase způsobuje mitochondrií otoky a následné narušení syntézy ATP a homeostázy iontu, což vede k buněčné smrti. Aktivace apoptózy bude hodnocena v pacientových a kontrolních buňkách v médiu obohaceném glukózou v různých časech. Pokračování buněčné smrti bude hodnoceno analyzátorem Muse Cell pomocí soupravy pro testování a testování života v anexinu v a testování mrtvých buněk a kaspázy-3/7 testovací soupravy.

Jako poslední další cíl bude v této studii stanoven IPSC. Do IPSC budou indukovány tři RFC1 a tři kontroly kultivační linie PF, ve spolupráci/dohledu s Dr. J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza. Tyto IPSC budou dále diferencovány na primární proprioceptivní neurony, protože smyslové neurony mají za následek vždy ovlivněné u pacientů s RFC1-Ataxií.