병원성 통찰력과 RFC1- 자금 시아/캔버스에서 바이오 마커 검색 (INSIDE-CANVAS)

연구 제안은 RFC1- 자극 환자의 코호트에서 전 세계 질병 심각도 및/또는 진행을 평가할 때 개별 검증 된 임상 등급 척도의 민감도를 평가하고 비교하는 주요 목표로 인식되어 RFC1- 아 후원에서 RFC1- 아 후미증에서 새로운 잠재적 순환 바이오 마커를 식별하기 위해 RFC1- 아 후원 및 II) II). 특히 미토콘드리아 기능과 관련하여 RFC1- 자금술의 병인에 대한 통찰력을 얻으십시오.

이러한 목적을 위해, 유전자 결정된 RFC1- 실험실 환자 (25 pts 치료 의도)의 연구 코호트의 종단 평가가 수행 될 것이다.

RFC1-Ataxia에 소뇌 및 독점 수용 시스템의 관여에 기초하여, 다음의 임상 등급 척도가 선택되었습니다 : SARA (Assessment and Rating and Rating and Rating), 국제 협동 조합 운동 실조 등급 척도 (ICARS), SEARS (SEARS), BERG BALAL SCALE (BBS) 및 TINETTI 평가 도구. 전정 증상은 DHI (Dizziness Handicap 재고 설문지)로 평가됩니다.

임상 중증도에 대한 통계적 분석을 위해, T0 (기준선) RFC1- 환자도 다음을 거칠 것이다.

1) 신경 생리 학적 연구 : EMG 및 신경 연구, 운동 및 감각이 4 개의 사지에서 기록 된 잠재력; 2) 비디오 헤드 충격 테스트에 의한 전정 기능 평가. 수집 된 데이터는 또한 다음을 포함 할 것이다 : 증상의 발병 연령 (AAO), 등록 연령 (AEA), 질병 지속 시간 (DD); 설명 할 수없는 기침 및/또는 삼키는 교란의 존재; 3T 뇌와 척수 MRI. 통계 분석은 Pearson의 상관 관계 테스트에 의해 수행됩니다. Global and item scores for each scale will be also correlated with DD, disability stage estimated by the SPATAX disability score (0: no functional handicap, 1: no functional handicap but signs at examination, 2: mild, able to run, unlimited walking, 3: moderate, unable to run, limited walking without aid, 4: severe, walking with one stick, 5: walking with two sticks, 6: unable to walk, requiring a wheelchair, 7: 침대에 국한) 및 기타 주요 진단 결과는 운동 장애 (즉, 신경 병증, 전정, 소뇌 위축)에 개별적으로 기여합니다.

두 번째 목표를 위해, 혈액 샘플은 RFC1- 실험실 코호트로부터 수집 될 것이며, T0 (기준선 방문) 및 T1 (1 년 추적 방문)에서 산화 스트레스 (OS) 및 신경에 필라멘트 경쇄 (NFL)의 패널을 평가하기 위해이 목적에 등록 된 나이와 성별 일치 건강한 대조군으로부터 수집 될 것이다. 혈청, 혈장 및 RNA를 얻기 위해 혈액 샘플을 처리합니다. 혈청 분석의 경우, 진공 (CAT 혈청 SEP 응고 활성화 제) 튜브 중 9 ​​CC의 혈액을 끌어 당기고, 1 시간 내에 원심 분리하고, 다수의 50 UL 분취 량에 분취 된 후 -80 ℃에 저장 될 것이다. 혈장 분석의 경우, 9cc의 혈액을 EDTA 튜브로 끌어 당기고 실온에서 30 '후에 원심 분리하고 50 UL 분취 량으로 분취되어 -80 ℃에서 저장 될 것이다. 마지막으로, 정맥 혈액은 EDTA와 함께 하나의 10 mL BD Vacutainer 튜브로 끌어 당기고, 총 RNA를 백혈구에서 추출하고 cDNA로 전환하여 -80 ℃에서 저장 될 것이다. 수집 된 모든 샘플은 수집 기간이 끝날 때 저장 될 것이며, 외부 서비스 (로마의 밤비노 게스 병원의 분자 의학 실험실)를 사용하여 동결 해동주기를 피하기 위해 동시에 배송되고 동시에 검사 될 것이다. 산화 스트레스 패널에는 전사 계수 NRF2 (핵 혈관 혈관 2 rroptrated related-pcred)의 발현이 포함됩니다. NRF2는 항산화 방어의 활성화, 염증 억제, 미토콘드리아 기능의 개선 및 단백질 항상성의 유지를 통해 많은 세포 보호 경로를 조절합니다. 주목할 점은,이 경로의 변화는 미토콘드리아 기능 장애, 특히 Friedreich anaxia와 관련된 신경 퇴행성 질환과 관련이있다. 항산화 반응과 관련된 혈청 마커는 다음과 같습니다 : 글루타티온 퍼 옥시 다제, 감소 된 글루타티온 (GSH) 및 산화 글루타티온 (GSSG) 및 글루타티온 대사 및 글루타티온 대사 (Gamma-Glutamylcysteine ​​Ligase, gamma-glutamylcysteine ​​ligase, eenctrome arimetric auged)에 의해 측정 된 Gamma-Glutamylcysteine ​​Ligase (Gamma-Glutamylcysteine ​​ligase). 면역 흡착제 분석 (ELISA).

NFL 수준은 Ella 자동 면역 분석에 의해 평가 될 것입니다. RFC1 환자 및 대조군 모두에서 얻은 결과는 Mann Whitney U-Test (Windows 용 BM SPSS 통계, 버전 24.0에 의해 통계적으로 비교됩니다. Armonk, NY)는 바이오 마커가 RFC1 환자에서 유의하게 다른지 테스트하고, 따라서 잠재적으로 질병 바이오 마커를 나타냅니다. 긍정적 인 결과의 경우, 질병 심각도 마커로서의 역할을 평가하기 위해, 그 수준은 코호트에서 테스트 된 것 중에서 가장 민감한 임상 등급 척도의 글로벌 및 항목 점수와 상관 관계가있을 것입니다. 또한, T0 및 T1에서의 수준은 질병 진행 바이오 마커로서 그들의 잠재적 역할을 평가하기 위해 캔버스 -RFC1 환자 대 대조군에서 비교 될 것이다.

또 다른 2 차 목표는 RFC1 환자 유래 섬유 아세포에서 미토콘드리아 기능의 깊은 특성화로 구성되고, 캔버스 환자의 조직에 대해 수행 된 미래의 연구에 대한 미래의 연구에 대한 유도 된 다수성 STEM (IPSC) 세포주의 확립은 명백히 정상적인 단백질 및 전 사체 수준을 보여 주지만 RFC1의 rfc1에서 rfc1 기능을 포함하는 연구 결과를 보여 주었다. 또는 수리) 및 관련 OXPHOS 결함은 지금까지 수행되지 않았습니다. 이를 위해, 환자- 및 대조군- 유래 1 차 섬유 아세포 (PF) (8 개의 별개의 RFC1 환자 및 8 명의 건강한 대조군)는 병렬로 분석 될 것이다. RFC1 단백질 및 mRNA 수준은 캔버스 PTS 및 대조군 사이의 RFC1 단백질 또는 전사 수준의 현저한 감소의 존재를 평가하기 위해 세포 용 해물로부터 추출 된 총 단백질 및 RNA에 대해 웨스턴 블롯 (WB) 및 정량적 (Q) PCR을 통해 정량화 될 것이다.

산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능에 대한 연구 : 연구자의 예비 데이터는 전자 현미경이 RFC1 환자의 명확한 미토콘드리아 비정질의 존재를 나타 내기 때문에 미토콘드리아 기능 장애가 RFC1- 아택 심전의 병인에 역할을 할 수 있다고 뒷받침한다 (2 개의 구별 된 세포 라인).

이 가설을 확인하기 위해, 미토콘드리아 기능은 RFC1에서 평가되고 다른 접근법에 의해 섬유 아세포를 제어 할 것이다.

i) 미토콘드리아 기능 장애의 존재는 종종 미토콘드리아의 역학, 형태 및 초 구조에서 변화와 관련이있다. 이러한 특징은 공 초점 및 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 조사 될 것이다. 생체 내 세포 영상화의 경우, 세포는 미토 트랙 커 레드 및 Hoechst (핵 프로브)로 염색 될 것이다. 그런 다음 A1 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 특정 소프트웨어 (Nikon Instruments)를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 세포는 필라멘트, 중간 및 단편화 된 미토콘드리아의 세 가지 범주로 점수를 매길 것입니다. 미토콘드리아 초 구조는 Tecnai G2 (FEI) TEM에 의해 초 고성 세포 ​​섹션에서 분석 될 것이다.

ii) 미토콘드리아 기능 장애는 또한 미토 개지를 활성화시킬 수 있으며, 결과적으로 미토콘드리아 질량의 감소는 세포 에너지 결함에 기여한다. 미토콘드리아 질량은 미토콘드리아 질량의 2 개의 미토콘드리아 단백질 지수 인 포린 및 TOM20의 면역 블롯에 의해 평가 될 것이다. 추가 지수로서, 시트 레이트 신타 제 활성, 분광 광도계에 의한 미토콘드리아 매트릭스 효소 및 qPCR에 의한 총 mtDNA 카피 수 모두를 측정 할 것이다.

iii) RFC1 세포에서 손상된 옥스 포스 공정의 존재를 강조하기 위해, 섬유 아세포는 미토콘드리아 옥스 포스를 이용하여 배양 배지에서 포도당으로 갈락토스를 대체함으로써 ATP를 합성해야한다. glycolysis 로의 갈락토스의 진입은 포도당보다 상당히 낮은 속도로 발생합니다. 따라서, RFC1 및 대조군 섬유 아세포는 최대 72 시간 동안 주요 에너지 기질로서 포도당 또는 갈락토스를 함유하는 DMEM에서 배양 될 것이며, 세포 성장이 분석 될 것이다. 옥스 포스를 깊이 조사하기 위해, 산소 소비율은 상태 4, 상태 3 및 결합되지 않은 호흡기 조건 하에서 디지토닌-투기 세포 (OCR)에서 측정 될 것이다. 또한, 환자의 섬유 아세포가 에너지 부족인지 확실히 확립하기 위해 세포 내 ATP 수준이 측정 될 것이다. 상태 4 및 상태 3 호흡 속도는 각각 포화 ADP의 존재하에 및 비 커플러 FCCP의 존재 하에서 각각 포화 ADP의 존재하에 측정 될 것이다. 복합체 I 기반 ATP 합성 속도는 위에서 설명한 상태 3 호흡기 조건 하에서 측정 될 것이다. 세포의 합성 된 ATP 또는 정상 상태 ATP 함량은 광학적 방법에 의해 정량화 될 것이다.

iv) 미토콘드리아 기능 장애는 미토콘드리아 막 전위 (MMP) 변화 및 ROS 생성을 초래한다. 따라서, 미토콘드리아의 주요 기능적 파라미터 인 MMP는 미토콘드리아 네트워크 및 내부 미토콘드리아 막 전위 Δψm의 변화를 검출하기 위해 형광 현미경 및 유세포 분석에 의해 세포에서 추정 될 것이다. Δψm은 Δψm- 의존적 방식으로 미토콘드리아에 들어가는 친 유성 프로브 인 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)로 세포를 로딩함으로써 측정 될 것이다. 세포는 ATP 신타 제 복합체의 특이 적 억제제 인 올리고 마이신의 부재 또는 존재하에 TMRM과 함께 및 FCCP 하에서 인큐베이션 될 것이다. 환자 및 대조군 섬유 아세포의 다수의 고출력 형광 이미지는 IAS2000 소프트웨어 (Delta Sistemi, Roma, Italy)를 사용하여 형광 역전 현미경으로 획득 될 것이다. 유세포 분석법에 의한 정량적 Δψm 분석을 위해, Muse Cell Analyzer (미국, MA, Billerica, Millipore)가 흐르는 소프트웨어 (Turku University, Biotechnology Center)를 적용하는데 사용될 것이다. 미토콘드리아 변경의 임의의 증거는 생체 내 평가와 동시에 옥스포스 복합체의 면역 블 롯팅 v)의 면역 블 롯팅 v) ros 수준의 가능한 기여와 결과적으로 세포 산화 스트레스의 가능한 기여는 RFC1- 아세스의 병인에 의해 배양 된 섬유 모세포에서 평가 될 것이다. Muse Cytometer를 사용하여 Cellrox Orange 형광 프로브에 의한 Mitosox Red 및 Cellular ROS 수준. ROS 변경이 세포의 항산화 방어 시스템의 변화에 ​​의존하는지 여부를 탐색하기 위해, 주요 항산화 효소의 수준 및 활성 및 총 및 감소 된 글루타티온 수준은 면역 블롯 및 분광 광도계 분석법에 의해 각각 평가 될 것이다.

vi) RFC1 섬유 아세포에서의 유의미한 미토콘드리아 변경의 발견은 미토콘드리아-유도 된 세포 사멸에 대한 그들의 경향을 조사하라는 메시지가있다. 증가 된 ROS는 내부 미토콘드리아 막에서 시클로 스포린-민감성 기공의 투과성 전이를 유도하여, 이는 미토콘드리아 팽창 및 결과적으로 ATP 합성 및 이온 항상성 둘 다의 파괴를 유발하여 세포 사멸을 초래한다. 아 pop 토 시스 활성화는 다른 시간에 포도당 농축 -DMEM 배지의 환자 및 대조군 세포에서 평가 될 것이다. Muse Count and Revility Assay Kit, Annexin V 및 Dead Cell Assay Kit 및 Caspase-3/7 분석 키트를 사용하여 Muse Count 및 생존력 분석 키트를 사용하여 Muse Cell Analyzer에 의해 세포 사멸에 대한 경향이 평가 될 것입니다.

마지막으로 추가 목표로,이 연구에서 IPSC가 확립 될 것입니다. 3 개의 RFC1 및 3 개의 컨트롤 PF 배양 라인이 IPSC로 유도 될 것이며, J Rosati 박사와 협력/감독하여 IRCCS CASA SOLLIEVO DELLA SOFFERENZA. 감각 뉴런이 RFC1- 자극 환자에게 항상 영향을 받기 때문에, 이들 IPSC는 1 차 독점 뉴런으로 추가로 분화 될 것이다.