Патогенные идеи и поиск биомаркеров в RFC1-атаксии/холсте (INSIDE-CANVAS)

The research proposal recognizes as the primary aim to evaluate and compare the sensitivity of individual validated clinical rating scales in assessing global disease severity and/or progression in a cohort of RFC1-ataxia patients Secondary aims are i) to identify novel potential circulating biomarkers in RFC1-ataxia by testing a cohort of RFC1-ataxia patients vs controls and ii) to establish and study patient-derived cell models Получить представление о патогенезе RFC1-атаксии, особенно в отношении митохондриальной функции.

Для этих целей будет проведена продольная оценка исследовательской когорты генетически определенных пациентов с RFC1-атаксией (намерение лечить 25 баллов).

Основываясь на участии мозжечковых и проприоцептивных систем в RFC1-атаксии, были отобраны следующие клинические оценки: масштаб для оценки и рейтинга атаксии (SARA), международной шкалы оценки атаксии (ICARS), шкала оценки сенсорной атаксии (SEARS), шкала баланса BBS) и Tinetti Tool. Вестибулярные симптомы будут оцениваться с помощью опросника инвентаризации головокружения (DHI).

Для статистического анализа, касающейся клинической тяжести, у пациентов с T0 (исходным уровнем) RFC1 также будут проходить:

1) Нейрофизиологические исследования: исследования ЭМГ и нерв, моторные и сенсорные вызванные потенциалы, зарегистрированные на четырех конечностях; 2) Оценка вестибулярной функции с помощью видео-импульса. Собранные данные также будут включать в себя: возраст в начале (AAO) симптомов, возраст при регистрации (AAE), продолжительность заболевания (DD); наличие необъяснимого кашля и/или глотания нарушений; 3T МРТ мозга и спинного мозга. Статистический анализ будет выполняться с помощью корреляционных тестов Пирсона. Глобальные оценки и оценки предметов для каждой шкалы также будут коррелировать с DD, стадией инвалидности, оцененной по оценке инвалидности по шпателям (0: без функционального гандикапа, 1: без функционального гандикапа, но признаки при осмотре, 2: мягкая, не способная бежать, без ограниченного ходьбы, 3: умеренный, не подлежащий пробежению, ограниченная ходьба, 4: Searre, ходьба с одной палкой, 5: ходьба, 6: Необходил. 7: ограничены слоем) и другие основные диагностические результаты, индивидуально способствующие двигательной инвалидности (то есть невропатия, вестибулопатия, атрофия мозжечка).

Для второй цели образцы крови будут собираться из когорты RFC1-атаксии и когорты по возрасту и пола, соответствующую здоровому контролю, включенной в эту цель для оценки панели циркулирующих биомаркеров окислительного стресса (OS) и нейрофиламентного светового цепи (NFL), при посещении базовой линии) и T1 (один год последующего посещения). Образцы крови будут обработаны для получения сыворотки, плазмы и РНК. Для анализа сыворотки будет проведено 9 куб. Для анализа плазмы 9 куб. См крови будут втянуты в пробирки ЭДТА, а через 30 'при комнатной температуре будут центрифугированы и аликвотируются в 50 аликвотах UL и хранятся при -80 ° C. Наконец, венозная кровь будет втянута в одну 10 -мл вактуиновую трубку BD с EDTA, а общая РНК будет извлечена из лейкоцитов и обратно транскрибируется в кДНК, которая будет храниться при -80 ° C. Все собранные образцы будут сохранены, в конце концов периода сбора будут отправлены и изучены одновременно в дубликате, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, используя внешнюю службу (Лаборатория молекулярной медицины больницы Bambino Gesù, Рим). Панель окислительного стресса будет включать в себя: экспрессию фактора транскрипции NRF2 (ядерный фактор erythroid 2-rel-pcrected 2). NRF2 регулирует многие цитопротекторные пути посредством активации антиоксидантной защиты, ингибирования воспаления, улучшения митохондриальной функции и поддержания гомеостаза белка. Следует отметить, что изменения в этом пути были связаны с нейродегенеративными заболеваниями, связанными с митохондриальной дисфункцией, в частности, атаксии Фридрейха. Serum markers related to antioxidant response include: glutathione peroxidase, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), and glutathione metabolism (gamma-glutamylcysteine ​​ligase, glutathione reductase) measured in sera by spectrophoto-fluorimetric assays and enzyme-linked Иммуносорбентный анализ (ELISA).

Уровни НФЛ будут оцениваться с помощью Alla Automatic ImmunoAspe. Результаты, полученные как у пациентов с RFC1 и контроля, будут статистически сравниваться с помощью U-теста Mann Whitney (статистика BM SPSS для Windows, версия 24.0. Armonk, NY), чтобы проверить, будут ли какие -либо биомаркеры значительно отличаться у пациентов с RFC1, что потенциально представляет биомаркер заболевания. В случае положительных результатов, чтобы оценить роль маркера тяжести заболевания, их уровни будут коррелироваться как с глобальными, так и с показателями элементов клинической оценки, наиболее чувствительными среди тестируемых в когорте. Кроме того, их уровни в T0 и T1 будут сравниваться у пациентов с Canvas -RFC1 с контролем, для оценки их потенциальной роли в качестве биомаркера прогрессирования заболевания.

Another secondary aim consists in the deep characterization of mitochondrial function in RFC1 patient-derived fibroblasts, and the establishment of Induced Pluripotent Stem (IPSc) cell lines for future research Previous studies conducted on CANVAS patients' tissues apparently showed normal protein and transcripts levels of RFC1, however studies concerning a putative RFC1 function in mtDNA mantainence (replication and/ or Ремонт) и связанный с ними дефект Oxphos до сих пор не выполнялись. С этой целью первичные фибробласты (PF) (PF) (PF) (8 различных пациентов RFC1 и 8 соответствующих здоровых контролей) будут проанализированы. Уровни белка RFC1 и мРНК будут количественно определены с помощью вестерн -блоттинга (WB) и количественной (Q) ПЦР, соответственно, на общем белке и РНК, экстрагированном из клеточного лизата, для оценки наличия какого -либо значительного снижения уровня белка RFC1 или транскрипта между PTS и контролями.

Исследования по окислительному стрессу и митохондриальной функции: предварительные данные исследователей подтверждают, что митохондриальная дисфункция может играть роль в патогенезе RFC1-атаксии, поскольку электронная микроскопия выявила наличие четких митохондриальных аномалий в фибрубластах пациентов с RFC1.

Чтобы проверить эту гипотезу, митохондриальная функция будет оцениваться в RFC1 и контролирует фибробласты различными подходами:

i) Наличие митохондриальной дисфункции часто связано с изменениями либо в динамике, морфологии и ультраструктуре митохондрий. Эти функции будут исследованы с помощью конфокальной и трансмиссионной электронной микроскопии (TEM). Для визуализации клеток in vivo клетки будут окрашены красным митотракером и Hoechst (ядерный зонд). Затем изображения будут сняты с использованием конфокального микроскопа A1, а анализ изображений будет выполняться с использованием конкретного программного обеспечения (Nikon Instruments). Клетки будут оцениваться в три категории: нитчатые, промежуточные и фрагментированные митохондрии. Ультраструктура митохондрий будет проанализирована на ультратонких фиксированных клетках с помощью TECNAI G2 (FEI) TEM.

ii) Митохондриальная дисфункция также может активировать митофагию с последующим снижением митохондриальной массы, способствующей дефекту энергии клеток. Митохондриальная масса будет оцениваться иммуноблотом порина и Tom20, двух митохондриальных белков индекса митохондриальной массы. В качестве дополнительных индексов будет измерено как цитрат -синтазная активность, и общее количество копий Mtochondrial с помощью QPCR с помощью QPCR.

iii) Чтобы подчеркнуть присутствие нарушенного процесса Oxphos в клетках RFC1, фибробласты будут вынуждены использовать митохондриальные Oxphos для синтеза АТФ путем замены галактозы на глюкозу в культивирующую среду. Въезд галактозы в гликолиз происходит с значительно более низкой скоростью, чем глюкоза. Таким образом, RFC1 и контрольные фибробласты будут культивированы в DMEM, содержащей либо глюкозу, либо галактозу в качестве основного энергетического субстрата в течение 72 часов, и будет проанализирован рост клеток. Чтобы глубоко исследовать Oxphos, скорость потребления кислорода будет измерена в цифронин-пермеабилизованных клетках (OCR) в состоянии 4, состоянии 3 и не связанных с респираторными условиями и максимальной скорости синтеза АТФ олигомицина. Кроме того, чтобы определенно установить, являются ли фибробласты пациентов с дефицитом энергии, будут измерены внутриклеточные уровни АТФ. Состояние 4 и скорости дыхания 3 и 3 будут измерены в отсутствие и в присутствии насыщающего ADP, соответственно, и неповторимого дыхания в присутствии необработанного FCCP (карбонил цианид-п-трифторметоксифенилгидразон). Скорость синтеза АТФ, управляемого комплексом, будет измерена в условиях дыхания 3, описанных выше. Синтезированное содержание ATP или ATP устойчивого состояния в клетках будет количественно определено люминометрическим методом.

IV) Дисфункция митохондрий приводит к изменениям митохондриальной мембранной мембраны (MMP) и выработке АФК. Таким образом, MMP, основной функциональный параметр митохондрий, будет оцениваться в клетках как с помощью флуоресцентной микроскопии, так и проточной цитометрии для обнаружения изменений как митохондриальной сети, так и внутренней митохондриальной мембранной мембраны Δψm. Δψm будет измерен погружающимися клетками с тетраметилргодамином метилового эфира (TMRM), липофильным зондом, который попадает в митохондрии Δψm-зависимым образом. Клетки будут инкубированы с TMRM либо в отсутствие, либо в присутствии олигомицина, специфического ингибитора комплекса Синтазы АТФ и при FCCP. Множество мощных флуоресцентных изображений пациентов и контрольных фибробластов будут получены с помощью флуоресцентного перевернутого микроскопа с использованием программного обеспечения IAS2000 (Delta Sistemi, Рома, Италия). Для количественного анализа ΔMM с помощью проточной цитометрии будет использоваться анализатор клеток MUSE (Millipore, Billerica, MA, USA), применяя плавное программное обеспечение (Центр биотехнологии, Университет Турку). Любые доказательства митохондриальных изменений будут дополнительно рассмотрены иммуноблоттингом комплексов oxphos v) параллельно оценке in vivo, возможным вкладу более высокого уровня АФК и последующего клеточного окислительного стресса в патогенез RFC1 -атаксии будут оцениваться в культивированных фибробластах, измеряя супероксид -анион (O2 • -) Mitosox Red и Cellular ROS -уровень с помощью оранжевого флуоресцентного зонда Cellrox с использованием цитометра Muse. Чтобы изучить, зависят ли АФК изменения от изменений в антиоксидантных системах защиты клеток, уровней и активности основных антиоксидантных ферментов и общего и пониженного уровня глутатиона будут оцениваться с помощью иммуноблот и спектрофотометрических анализов соответственно.

vi) обнаружение значительных митохондриальных изменений в фибробластах RFC1 будет подсказывать исследование их склонности к гибели клеток, вызванной митохондриальным. Повышенная АФК индуцирует переход проницаемости чувствительной к циклоспорину пор во внутренней митохондриальной мембране, которая, в свою очередь, вызывает отек митохондрий и последующее нарушение как синтеза АТФ, так и ионного гомеостаза, что приводит к гибели клеток. Активация апоптоза будет оцениваться в пациентах и ​​контрольных клетках в среде, обогащенной глюкозой, в разное время. Придужность к гибели клеток будет оцениваться с помощью анализатора клеток Muse с использованием набора для анализа Muse и анализа жизнеспособности, набора для анализа Annexin V и Dead Cell и набора для анализа каспазы-3/7.

Как последняя дополнительная цель, в этом исследовании будут созданы IPSCS. Три RFC1 и три контрольных культурных линии PF будут вызваны IPSCS, в сотрудничестве с доктором J Rosati, IRCCS Casa Sollievo Della Sofferenza. Эти IPSC будут дальнейшим дифференцированным в первичные проприоцептивные нейроны, поскольку сенсорные нейроны неизменно приводят к пациентам с RFC1-атаксии.