Patogen indsigt og søgning efter biomarkører i RFC1-ataksi/lærred (INSIDE-CANVAS)

Forskningsforslaget anerkender som det primære mål at evaluere og sammenligne følsomheden af ​​individuelle validerede kliniske ratingskalaer i vurderingen af ​​den globale sygdomsgrad og/eller progression i en kohort af RFC1-ataxi-patienter sekundære mål er i) for at identificere nye potentielle cirkulerende biomarkører i RFC1-ATAXIA ved at teste a-kohort af RFC1-ATAXIA-patienterne kontrol Modeller for at få indsigt om patogenese af RFC1-ataksi, især vedrørende mitokondrisk funktion.

Til disse formål vil en langsgående vurdering af en undersøgelsesgruppe af genetisk bestemt RFC1-ataksi-patienter (intention om at behandle 25 punkter) blive udført.

Baseret på involvering af cerebellare og propriosceptive systemer i RFC1-ataksi er følgende kliniske bedømmelsesskalaer blevet valgt: skala til vurdering og bedømmelse af ataksi (SARA), International Cooperative Ataxia Rating Scale (ICARS), Sensory Ataxia Rating Scale (SEARS), BERG Balance Scale (BBS) og TINETTI Assessment Tool. Vestibulære symptomer vurderes ved hjælp af svimmelhed handicap Inventory Spørgeskema (DHI).

Til statistisk analyse vedrørende klinisk sværhedsgrad ved T0 (baseline) vil RFC1-patienter også gennemgå:

1) neurofysiologiske undersøgelser: EMG- og nervestudier, motoriske og sensoriske fremkaldte potentialer registreret ved de fire lemmer; 2) Vestibular funktionsvurdering ved video-hovedimpuls-test. Indsamlede data vil også omfatte: alder ved begyndelse (AAO) af symptomer, alder ved tilmelding (AAE), sygdomsvarighed (DD); tilstedeværelse af uforklarlig hoste og/eller sluge forstyrrelser; 3t hjerne og rygmarv MRI. Statistisk analyse udføres af Pearsons korrelationstest. Globale og varescore for hver skala vil også blive korreleret med DD, handicapstadium estimeret af spatax handicap score (0: ingen funktionelt handicap, 1: ingen funktionel handicap men tegn ved undersøgelse, 2: mild, i stand til at løbe, ubegrænset gå Rullestol, 7: begrænset til en seng) og andre større diagnostiske fund, der individuelt bidrager til motorisk handicap (dvs. neuropati, vestibulopati, cerebellar atrofi).

For det andet mål indsamles blodprøver fra RFC1-ataksi-kohorten og en kohort af alder og køn matchede sunde kontroller, der er tilmeldt dette formål med vurderingen af ​​et panel af cirkulerende biomarkører for oxidativt stress (OS) og neurofilament lyskæde (NFL), både ved T0 (baselinbesøg) og T1 (et år efter opfølgning). Blodprøver behandles for at opnå serum, plasma og RNA. Til serumanalyser tegnes 9 cc blod i vakuette (Cat Serum Sep Clot Activator) rør, centrifugeret inden for 1 time, alikvoteret i flere 50 UL -portioner og opbevares ved -80 ° C. Til plasmaanalyser vil 9 cc blod blive trukket ind i EDTA -rørene, og efter 30 'ved stuetemperatur vil det blive centrifugeret og alikvoteret i 50 UL -portioner og opbevaret ved -80 ° C. Til sidst vil venøst ​​blod blive trukket ind i et 10 ml BD -vakutainerrør med EDTA, og total RNA vil blive ekstraheret fra leukocytter og omvendt transkribert til cDNA, der vil blive opbevaret ved -80 ° C. Alle de indsamlede prøver gemmes derefter ved afslutningen af ​​indsamlingsperioden, vil blive sendt og undersøgt samtidig i duplikat for at undgå frysetøningscyklusser, ved hjælp af en ekstern service (laboratorium af molekylær medicin fra Bambino gesù hospital, Rom) Oxidativt stresspanel vil omfatte: Ekspression af transkriptionsfaktoren nrf2 (NUCLEAL FACTOR ERYTHROID 2) Oxidativt 2) Analy Time-PCR. NRF2 regulerer mange cytoprotektive veje gennem aktivering af antioxidantforsvar, inhibering af inflammation, forbedring af mitokondrial funktion og vedligeholdelse af proteinhomeostase. Det bemærkes, at ændringer i denne vej har været forbundet med neurodegenerative sygdomme forbundet med mitokondrisk dysfunktion, især Friedreich ataxia. Serummarkører relateret til antioxidantrespons inkluderer: glutathionperoxidase, reduceret glutathion (GSH) og oxideret glutathion (GSSG) og glutathion metabolisme (Gamma-glutamylcystein ligase, glutathion-reduktase) Målet i Sera ved spektrophoto-fluorimetric Assays and Enzyme-Linkne-LINTUTACE) Målet i SERA ved spektrophoto-fluorimetric Assays and Enzyme-Linked-LINCEMINGESE Immunosorbentassay (ELISA).

NFL -niveauer vurderes af ELLA automatiseret immunoassay. Resultater opnået hos både RFC1-patienter og -kontroller sammenlignes statistisk med Mann Whitney U-test (BM SPSS-statistik for Windows, version 24.0. Armonk, NY) for at teste, om nogen biomarkører ville være signifikant forskellig hos RFC1 -patienter, hvilket potentielt repræsenterer en sygdomsbiomarkør. I tilfælde af positive resultater, for at vurdere rollen som en sygdomsgrad -markør, vil deres niveauer være korreleret både med globale og varescore for den kliniske vurderingsskala, der er den mest følsomme blandt dem, der er testet i kohorten. Deres niveauer ved T0 og T1 vil også blive sammenlignet hos lærred -RFC1 -patienter vs kontroller til evaluering af deres potentielle rolle som sygdomsprogression biomarkør.

Et andet sekundært mål består i den dybe karakterisering af mitokondrisk funktion i RFC1-patientafledte fibroblaster, og etablering af induceret pluripotente STEM (iPSC) cellelinjer til fremtidige forskning Tidligere undersøgelser udført på lærredspatienternes væv, der tilsyneladende viste normal protein- og transkriptionsniveauer af RFC1, men undersøgelser Concerning A Putative RFC1-funktion i mtDNA Mantain og Replikation og ordrepapirer og ordreparation og ordreparation og ordreparation og ordreparation og ordreparation og ordre) Relateret OXPHOS -defekt er ikke blevet udført indtil videre. Til dette formål analyseres patienter- og kontrol-afledte primære fibroblaster (PF) (8 forskellige RFC1-patienter og 8 matchede sunde kontroller) parallelt. RFC1 -protein- og mRNA -niveauer vil blive kvantificeret gennem Western blot (WB) og kvantitativ (Q) PCR, henholdsvis på total protein og RNA ekstraheret fra cellelysat for at vurdere tilstedeværelsen af ​​enhver signifikant reduktion i RFC1 -protein- eller transkriptionsniveauer mellem lærred PT'er og kontroller.

Undersøgelser af oxidativ stress og mitokondrisk funktion: foreløbige data fra efterforskerne understøtter, at mitokondrisk dysfunktion muligvis kunne spille en rolle i patogenesen af ​​RFC1-ataxi, da de elektronmikroskopier afslørede tilstedeværelsen af ​​klare mitokondriske abnormaliteter i RFC1-patienters afgrænsede fibrober (to forskellige celle-linjer).

For at verificere denne hypotese vurderes mitokondrial funktion i RFC1 og kontrollerer fibroblaster ved forskellige tilgange:

i) Tilstedeværelsen af ​​mitokondrial dysfunktion er ofte forbundet med ændringer enten i dynamik, morfologi og ultrastruktur af mitokondrier. Disse funktioner vil blive undersøgt af konfokal og transmissionselektronmikroskopi (TEM). Til in vivo -celleafbildning er celler farvet med mitotracker rød og hoechst (nuklear sonde). Billeder optages derefter ved hjælp af et A1 -konfokalt mikroskop, og billedanalyse udføres ved hjælp af en bestemt software (Nikon Instruments). Celler vil blive scoret i tre kategorier: filamentøse, mellemliggende og fragmenterede mitokondrier. Mitochondria -ultrastruktur analyseres på ultrathin -faste cellersektioner af en Tecnai G2 (Fei) TEM.

ii) Mitochondrial dysfunktion kan også aktivere mitofagi, med deraf følgende fald i den mitokondriske masse, der bidrager til cellenergdefekt. Mitochondrial masse vil blive vurderet ved immunoblot af porin og TOM20, to mitokondrielle proteinerindeks for mitokondrial masse. Som yderligere indekser, både citratsyntaseaktivitet, måles et mitokondrisk matrixenzym, ved spektrofotometri og total mtDNA -kopienummer med qPCR.

iii) For at fremhæve tilstedeværelsen af ​​nedsat OXPHOS -proces i RFC1 -celler vil fibroblaster blive tvunget til at anvende mitokondrielle oxphos til at syntetisere ATP ved at erstatte galactose med glukose i dyrkningsmedium. Indtræden af ​​galactose i glycolyse forekommer med en signifikant lavere hastighed end glukose. Så RFC1 og kontrolfibroblaster vil blive dyrket i DMEM indeholdende enten glukose eller galactose som hovedenergisubstrat i op til 72 timer, og cellevækst vil blive analyseret. For dybt at undersøge OXPHOS måles iltforbrugshastighed i digitonin-permeabiliserede celler (OCR) under tilstand 4, tilstand 3 og frakoblede respiratoriske forhold og den maksimale hastighed af oligomycinfølsom ATP-syntese. For bestemt at fastslå, om patienters fibroblaster er energimangel, måles intracellulære ATP -niveauer. Stat 4 og tilstand 3-respirationshastigheder måles i henhold til henholdsvis mættet ADP og den ikke-koblede respiration i nærvær af ukobleren FCCP (carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon). Det komplekse I -drevne ATP -syntese vil blive målt under de ovenfor beskrevne tilstand 3 beskrevet ovenfor. Den syntetiserede ATP eller stabil tilstand ATP -indhold af celler kvantificeres ved en luminometrisk metode.

iv) Mitokondrial dysfunktion fører til mitokondrisk membranpotentiale (MMP) ændringer og ROS -produktion. Således vil MMP, en hovedfunktionel parameter for mitokondrier, estimeres i celler ved både fluorescensmikroskopi og flowcytometri for at detektere ændringer af både mitokondrisk netværk og det indre mitokondriske membranpotentiale Δψm. Δψm måles ved belastning af celler med tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), en lipofil sonde, der kommer ind i mitokondrier på en ΔψM-afhængig måde. Celler inkuberes med TMRM enten i fravær eller tilstedeværelse af oligomycin, en specifik hæmmer af ATP -syntase -komplekset og under FCCP. Flere fluorescensbilleder med høj effekt af patienter og kontrollerer fibroblaster vil blive erhvervet ved fluorescens inverteret mikroskop ved hjælp af IAS2000-software (Delta Sistemi, Roma, Italien). Til kvantitativ ΔψM -analyse ved flowcytometri vil en musecelleanalysator (Millipore, Billerica, MA, USA) blive brugt på anvendelse af den flydende software (Center for Biotechnology, University of Turku). Any evidence of mitochondrial alterations will be further addressed by immunoblotting of OXPHOS complexes v) in parallel to in vivo assessment, the possible contribution of higher ROS level and consequent cellular oxidative stress in the pathogenesis of RFC1-ataxia will be evaluated in cultured fibroblasts, by measuring anion superoxide radical (O2 • -) mitochondrial levels by the Fluorescerende sonde mitosox rød og cellulær ROS -niveau ved cellrox orange fluorescerende sonde ved hjælp af et musecytometer. For at undersøge, om ROS -ændringer afhænger af ændringer i antioxidantforsvarssystemerne i cellerne, vil niveauer og aktiviteter af de vigtigste antioxidantenzymer og samlede og reducerede glutathionniveau blive vurderet ved henholdsvis immunoblot og spektrofotometriske assays.

vi) Fundet af betydelige mitokondriske ændringer i RFC1-fibroblaster vil tilskynde til at undersøge deres proneness til mitokondrial induceret celledød. Forøget ROS inducerer permeabilitetsovergang af den cyclosporinfølsom pore i den indre mitokondriske membran, hvilket igen forårsager mitokondrier hævelse og den deraf følgende forstyrrelse af både ATP-syntese og ionhomeostase, hvilket fører til celledød. Apoptoseaktivering vurderes i patient- og kontrolceller i glukoseberiget-DMEM-medium på forskellige tidspunkter. Proneness til celledød evalueres af Muse-celleanalysatoren ved hjælp af museantal og levedygtighedsassay-kit, Annexin V og Dead Cell Assay Kit og caspase-3/7-assay-kit.

Som det sidste yderligere mål, i denne undersøgelse, etableres iPSC'er. Tre RFC1 og tre kontroller PF -kulturlinjer vil blive induceret til iPSC'er, i samarbejde/overvågning med Dr. J Rosati, IRCCS CASA Sollievo Della Sofferenza. Disse IPSC vil blive yderligere differentieret til primære propriosceptive neuroner, da sensoriske neuroner resulterer altid påvirket af RFC1-ataksi-patienter.