Pathogene Erkenntnisse und Suche nach Biomarkern bei RFC1-Ataxie/Leinwand (INSIDE-CANVAS)

Der Forschungsvorschlag erkennt das primäre Ziel an, die Empfindlichkeit einzelner validierter klinischer Bewertungsskalen bei der Bewertung der Schweregrad und/oder des Progression des globalen Erkrankung in einer Kohorte von RFC1-Ataxia-Patienten zu bewerten und zu vergleichen. Einblick in die Pathogenese der RFC1-Ataxie, insbesondere in Bezug auf die mitochondriale Funktion.

Für diese Zwecke wird eine Längsschnittbewertung einer Studienkohorte gentechnisch bestimmter RFC1-Ataxie-Patienten (Absicht zur Behandlung von 25 Punkten) durchgeführt.

Basierend auf der Einbeziehung von Kleinhirn- und propriozeptiven Systemen bei RFC1-Ataxia wurden die folgenden klinischen Bewertungsskalen ausgewählt: Skala für die Bewertung und Bewertung von Ataxie (SARA), International Cooperative Ataxia Rates Scale (ICARS), Sensory Ataxia Rating Scale (SEARS), TOINSY-TOINSY-Bewertungsskala (SEARS), BBER (BBS) sowie TINETTI-Bewertungswerkzeuge sowie Tinteett-Tinten-Ataxia-Tools. Vestibuläre Symptome werden durch Dizziness Handicap Inventory Fragebogen (DHI) bewertet.

Für die statistische Analyse bezüglich des klinischen Schweregrads werden RFC1-Patienten bei T0 (Basislinie) ebenfalls unterzogen:

1) Neurophysiologische Studien: EMG- und Nervenuntersuchungen, motorische und sensorische Evozed -Potentiale, die an den vier Gliedmaßen aufgezeichnet wurden; 2) Bewertung der vestibulären Funktion durch Video-Head-Impulse-Test. Zu den gesammelten Daten gehören auch: Alter zu Beginn (AAO) von Symptomen, Alter bei der Aufnahme (AAE), Krankheitsdauer (DD); Vorhandensein ungeklärter Husten und/oder Schluckenstörungen; 3t Gehirn und Rückenmark MRT. Die statistische Analyse wird durch Pearsons Korrelationstests durchgeführt. Die globalen und Artikelwerte für jede Skala werden auch mit DD korreliert, die durch den Spatax Disability Score geschätzte Behinderungsstufe (0: kein funktionales Handicap, 1: Kein funktionelles Handicap, aber Zeichen bei der Untersuchung, 2: mild, in der Lage, zu rennen, unbegrenzte Gehen, 3: gemäßigte, nicht laufen, ohne Hilfe ohne Hilfe, 4 nicht zu gehen. ein Bett) und andere wichtige diagnostische Befunde, die einzeln zur motorischen Behinderung beitragen (d. H. Neuropathie, Vestibulopathie, Kleinhirnatrophie).

Für das zweite Ziel werden Blutproben aus der RFC1-Ataxia-Kohorte und einer Kohorte von Alter und geschlechtsunternehmen gesunden Kontrollpersonen für die Bewertung einer Gruppe zirkulierender Biomarker für oxidativen Stress (OS) und OS-Nachuntersuchung (One-Years-Nachuntersuchung) und T1 (One-Years-Nachuntersuchung) entnommen. Blutproben werden verarbeitet, um Serum, Plasma und RNA zu erhalten. Für Serumanalysen wird 9 ccm Blut in Vakuette (Cat -Serum -SEP -Gerinnselaktivator) gezogen, innerhalb von 1 Stunde zentrifugiert, in mehreren 50 UL -Aliquots aliquotiert und bei -80 ° C gelagert. Für Plasmaanalysen werden 9 cm lange Blut in EDTA -Röhrchen gezogen und nach 30 Zoll bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 50 UL -Aliquots aliquotiert und bei -80 ° C gelagert. Zuletzt wird venöses Blut in ein 10 -ml -BD -Vacutainer -Röhrchen mit EDTA gezogen, und die Gesamt -RNA wird aus Leukozyten extrahiert und in cDNA umgekehrt, die bei -80 ° C gelagert werden. All the samples collected will be stored, then, at the end of the collection period, will be shipped and examined simultaneously in duplicate to avoid freeze-thaw cycles, using an external service (laboratory of Molecular Medicine of the Bambino Gesù Hospital, Rome) The oxidative stress panel will include: expression of the transcription factor NRF2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) analyzed by Real Time-PCR. Nrf2 reguliert viele zytoprotektive Wege durch die Aktivierung von antioxidativen Abwehrkräften, die Hemmung der Entzündung, die Verbesserung der mitochondrialen Funktion und die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase. Bemerkenswerterweise wurden Änderungen in diesem Weg mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die mit mitochondrialen Dysfunktionen, insbesondere Friedreich -Ataxie, verbunden sind. Serum markers related to antioxidant response include: glutathione peroxidase, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), and glutathione metabolism (gamma-glutamylcysteine ​​ligase, glutathione reductase) measured in sera by spectrophoto-fluorimetric assays and enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Die NFL -Spiegel werden von Ella Automated Immunoassay bewertet. Die Ergebnisse sowohl bei RFC1-Patienten als auch bei Kontrollpersonen werden statistisch durch Mann Whitney U-Test (BM SPSS-Statistik für Windows, Version 24.0) verglichen. Armonk, NY), um zu testen, ob sich Biomarker bei RFC1 -Patienten signifikant unterscheiden, was möglicherweise einen Krankheitsbiomarker darstellt. Bei positiven Ergebnissen werden ihre Werte zur Beurteilung der Rolle als Schweregradmarker der Erkrankung sowohl mit den globalen als auch mit Artikelwerten der klinischen Bewertungsskala korreliert, die unter den in der Kohorte getesteten am sensibelsten sind. Außerdem werden ihre Spiegel bei T0 und T1 bei Canvas -RFC1 -Patienten gegenüber Kontrollen verglichen, um ihre potenzielle Rolle als Biomarker für Krankheiten zu bewerten.

Ein weiteres sekundäres Ziel besteht aus der tiefen Charakterisierung der Mitochondrienfunktion bei von RFC1-Patienten stammenden Fibroblasten und der Etablierung von induzierten pluripotenten Stem-Zelllinien (iPSC) für zukünftige Forschungsstudien frühere Studien, die bei Canvas-Patienten mit Leinwandpatienten durchgeführt wurden, zeigten offenbar normale Protein- und Transkriptionsniveaus. Die Replikationen. Reparaturen) und verwandter Oxphos -Defekt wurden bisher nicht durchgeführt. Zu diesem Zweck werden Patienten- und Kontroll-abgeleitete primäre Fibroblasten (PF) (8 verschiedene RFC1-Patienten und 8 übereinstimmende gesunde Kontrollen) parallel analysiert. RFC1 -Protein- und mRNA -Spiegel werden durch Western -Blot (WB) bzw. quantitative (q) -PCR auf Gesamtprotein und RNA aus Zelllysat quantifiziert, um das Vorhandensein einer signifikanten Verringerung des RFC1 -Protein- oder Transkriptionsspiegels zwischen Canvas -PTs und Kontrollen zu bewerten.

Studien zu oxidativem Stress und mitochondrialer Funktion: Vorläufige Daten der Forscher stützen, dass mitochondriale Dysfunktionen eine Rolle bei der Pathogenese von RFC1-Ataxie spielen könnten, da die Elektronenmikroskopie das Vorhandensein klaren mitochondrialen Abnormalitäten bei RFC1-Patienten 'abgeleitete Fibroblasten (zwei unterschiedliche Zellenliege) ergab.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wird die Mitochondrienfunktion in RFC1 bewertet und kontrolliert Fibroblasten durch verschiedene Ansätze:

i) Das Vorhandensein einer mitochondrialen Dysfunktion ist häufig mit Veränderungen in der Dynamik, Morphologie und Ultrastruktur von Mitochondrien verbunden. Diese Merkmale werden durch konfokale und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Für die In -vivo -Zellbildgebung werden Zellen mit Mitotracker -Rot und Hoechst (Kernsonde) gefärbt. Die Bilder werden dann unter Verwendung eines A1 -konfokalen Mikroskops erfasst und die Bildanalyse mit einer bestimmten Software (Nikon Instruments) durchgeführt. Zellen werden in drei Kategorien bewertet: filamentöse, mittlere und fragmentierte Mitochondrien. Mitochondrien -Ultrastruktur werden auf ultradünnen fixierten Zellenabschnitten durch einen Tecnai G2 (FEI) TEM analysiert.

ii) Die mitochondriale Dysfunktion kann auch die Mitophagie aktivieren, wobei sich die mitochondriale Masse abnimmt, die zum Zell -Energie -Defekt beiträgt. Die Mitochondrienmasse wird durch Immunoblot von Porin und Tom20 bewertet, zwei mitochondriale Proteineindex der Mitochondrienmasse. Als zusätzliche Indizes werden sowohl die Citrat -Synthase -Aktivität, ein mitochondriales Matrixenzym, nach Spektrophotometrie als auch die Gesamtmummer der mtDNA -Kopien durch qPCR gemessen.

III) Um das Vorhandensein eines beeinträchtigten Oxphos -Prozesses in RFC1 -Zellen hervorzuheben, werden Fibroblasten gezwungen sein, mitochondriale Oxphos zu verwenden, um ATP zu synthetisieren, indem Galactose in Kultivierungsmedium durch Galactose durch Glukose ersetzt wird. Der Eintritt von Galactose in die Glykolyse erfolgt bei einer signifikant niedrigeren Rate als Glukose. Daher werden RFC1- und Kontrollfibroblasten in DMEM kultiviert, das entweder Glucose oder Galactose als Hauptenergiesubstrat für bis zu 72 Stunden enthält, und das Zellwachstum wird analysiert. Um Oxphos tief zu untersuchen, wird die Sauerstoffverbrauchsrate in Digitonin-permeabilisierten Zellen (OCR) gemäß Zustand 4, Zustand 3 und entkoppelten Atembedingungen und der maximalen Rate der Oligomycin-sensitiven ATP-Synthese gemessen. Um definitiv festzustellen, ob die Fibroblasten der Patienten Energiefehler sind, werden intrazelluläre ATP -Spiegel gemessen. State 4 und State 3 Atmungsraten werden in Abwesenheit bzw. in Gegenwart von Sättigungs-ADP und der entkoppelten Atmung in Gegenwart des Entkoppels FCCP (Carbonylcyanid-P-Trifluoromethoxyphenylhydrazon) gemessen. Die vom Komplex I angesteuerte ATP -Syntheserate wird unter den oben beschriebenen Atemwegsbedingungen gemessen. Der synthetisierte ATP- oder Steady -State -ATP -Gehalt von Zellen wird durch eine luminometrische Methode quantifiziert.

iv) Mitochondriale Dysfunktion führt zu Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) und der ROS -Produktion. Somit wird MMP, ein Hauptfunktionsparameter von Mitochondrien, in Zellen sowohl durch Fluoreszenzmikroskopie als auch durch Durchflusszytometrie geschätzt, um Veränderungen sowohl des mitochondrialen Netzwerks als auch des inneren mitochondrialen Membranpotentials Δψm nachzuweisen. Δψm wird durch Belastung von Zellen mit Tetramethylrhodamin-Methylester (TMRM) gemessen, einer lipophilen Sonde, die in Mitochondrien in Δψm-abhängige Weise in Mitochondrien eingeht. Zellen werden mit TMRM entweder in Abwesenheit oder Gegenwart von Oligomycin, einem spezifischen Inhibitor des ATP -Synthasekomplexes, und unter FCCP inkubiert. Mehrere Hochleistungsfluoreszenzbilder von Patienten und Kontrollfibroblasten werden durch Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung der IAS2000-Software (Delta Sistemi, Roma, Italien) aufgenommen. Für die quantitative Δψm -Analyse durch Durchflusszytometrie wird ein Musecell -Analysator (Millipore, Billerica, MA, USA) verwendet, um die fließende Software (Center for Biotechnology, University of Turku) anzuwenden. Alle Hinweise auf mitochondriale Veränderungen werden durch Immunblotting von Oxphos -Komplexen v) parallel zur In -vivo -Beurteilung weiter angegangen, der mögliche Beitrag des höheren ROS -Spiegels und der daraus resultierenden zellulären oxidativen Stress bei der Pathogenese von RFC1 -Ataxie werden in kultivierten Fibroblasts durch die Messung von RFC1 -Ataxie bewertet. Probe -Mitosox -Rot und zellulärer ROS -Spiegel durch die Cellrox -Orangenfluoreszenzsonde unter Verwendung eines Muse -Zytometers. Um zu untersuchen, ob ROS -Veränderungen von Veränderungen in den antioxidativen Verteidigungssystemen der Zellen abhängen, werden Niveaus und Aktivitäten der Haupt -Antioxidationsenzyme und der Gesamt- und verringerten Glutathionspiegel durch immunoblot bzw. spektrophotometrische Assays bewertet.

vi) Die Erkenntnis signifikanter mitochondrialer Veränderungen bei RFC1-Fibroblasten wird dazu veranlasst, ihre Analyse zum mitochondrialen induzierten Zelltod zu untersuchen. Erhöhter ROS induziert den Permeabilitätsübergang der Cyclosporin-sensitiven Pore in der inneren mitochondrialen Membran, was wiederum eine Schwellung von Mitochondrien verursacht und die daraus resultierende Störung sowohl der ATP-Synthese als auch der Ionenhomöostase führt, was zum Zelltod führt. Die Apoptoseaktivierung wird bei Patienten- und Kontrollzellen in Glukoseanreicher-DMEM-Medium zu unterschiedlichen Zeiten bewertet. Die Aussprache zum Zelltod wird vom Muse Cell Analyzer unter Verwendung des Muse Count- und Lebensfähigkeits-Assay-Kits, Annexin V und Dead Cell Assay Kit und Caspase-3/7-Assay-Kit bewertet.

In dieser Studie werden IPSCs als das letzte zusätzliche Ziel festgelegt. Drei RFC1- und drei Kontrollen PF -Kulturlinien werden in IPSCs in Zusammenarbeit/Überwachung mit Dr. J. Rosati, Irccs Casa Sollievo Della Sofferenza, induziert. Diese IPSC werden weiter in primäre propriozeptive Neuronen differenziert, da sensorische Neuronen bei RFC1-Ataxie-Patienten immer wieder betroffen sind.