Patogenne spostrzeżenia i poszukiwania biomarkerów w RFC1-Ataxia/Canvas (INSIDE-CANVAS)

Propozycja badań uznaje za główny cel oceny i porównywania wrażliwości indywidualnych zatwierdzonych skal oceny klinicznej w ocenie globalnej nasilenia i/lub postępu w grupie pacjentów z RFC1-ATASJE Wtórne cele są I) w celu zidentyfikowania nowych potencjalnych biomarkerów krążących biomarkerów w RFC1-Ataxia przez RFC1-Ataxia przez RFC1-Ataxia przez RFC1-Ataxia. Modele, aby uzyskać wgląd w patogenezę RFC1-ATAXIA, szczególnie w odniesieniu do funkcji mitochondriów.

Do tych celów przeprowadzona zostanie podłużna ocena badanej grupy genetycznie określonych pacjentów z ataksją RFC1 (zamiar leczenia 25 pkt).

W oparciu o zaangażowanie układów móżdżku i proprioceptywnych w RFC1-Ataxia, wybrano następujące skale oceny klinicznej: skala do oceny i oceny ataksji (SARA), narzędzia oceny międzynarodowej (ICARS), sensorycznej skali oceny ataksji (SEARS), Skala bilansu Berg (BBS) oraz Tinetti. Objawy przedsionkowe zostaną ocenione na podstawie kwestionariusza zapasów handicapowych zawrotnych (DHI).

W przypadku analizy statystycznej dotyczącej nasilenia klinicznego, w T0 (wyjściowym) RFC1- pacjenci również zostaną poddane:

1) Badania neurofizjologiczne: badania EMG i nerwowe, potencjały wywołane motorycznie i sensorycznie zarejestrowane na czterech kończynach; 2) Ocena funkcji przedsionkowej za pomocą testu głowicy wideo. Zebrane dane będą również obejmować: wiek na początku (AAO) objawów, wiek na rejestrację (AAE), czas trwania choroby (DD); obecność niewyjaśnionych zakłóceń kaszlu i/lub połykania; MRI mózgu i rdzenia kręgowego 3T. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona za pomocą testów korelacji Pearsona. Wyniki globalne i pozycje dla każdej skali będą również skorelowane z DD, etap niepełnosprawności oszacowany przez ocenę niepełnosprawności spatax (0: brak funkcjonalnego handicapu, 1: Brak funkcjonalnego handicapu, ale znaki na badaniu, 2: łagodne, zdolne do biegania, nieograniczonym chodzenie, 3: Umiarkowane, niezdolne do biegania, ograniczona pomocy, 4: ciężkie, ciężkie, chodzenie z jednym kijem, 5: Dopasowanie dwóch patyków, 6: Undermited chodzenie, 3: Umiarkowane, niezdolne do biegania, ograniczoną chodzenie, 4: Surowe chodzenie z jednym kikiem, 5: Dopertowanie dwóch patyków, 6: Ułączanie się, wymaganie, wymagane, wymagane przez 7:00. ograniczone do łóżka) i innych głównych ustaleń diagnostycznych indywidualnie przyczyniających się do niepełnosprawności ruchowej (tj. Neuropatia, przedsionka, zanik móżdżku).

W drugim celu próbki krwi zostaną pobrane z kohorty RFC1-Ataxia i kohorty wieku i płci dopasowanego do zdrowych kontroli włączonych do tego celu do oceny panelu krążących biomarkerów stresu oksydacyjnego (OS) i neurofilamentowego łańcucha światła (NFL), zarówno na T0 (wizyta na basenu) i T1 (roczna wizyta w jego następstwie). Próbki krwi zostaną przetworzone w celu uzyskania surowicy, osocza i RNA. W przypadku analiz w surowicy lampa będzie rysowana 9 cm3 krwi w próżni (Cat Serum SEP Active Active), odwirowane w ciągu 1 godziny, usiane na wielu 50 próbach UL i przechowywane w temperaturze -80 ° C. W przypadku analiz plazmowych 9 cm3 krwi zostanie wciągniętych do rur EDTA, a po 30 'w temperaturze pokojowej zostanie odwirowane i usiane w 50 próbach UL i przechowywane w -80 ° C. Na koniec krew żylna zostanie wciągnięta w jedną 10 ml rurki wakutainowej BD z EDTA, a całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z leukocytów i przetranspiskującą się do cDNA, która zostanie przechowywana w -80 ° C. Wszystkie zebrane próbki zostaną przechowywane, a następnie, pod koniec okresu zbierania, zostaną wysłane i zbadane jednocześnie w duplikatach, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, przy użyciu usługi zewnętrznej (laboratoryjne medycyny molekularne szpitala Bambino Gesù analizy Rzym), Rzym), że panel stresu utleniający. NRF2 reguluje wiele szlaków cytoprotekcyjnych poprzez aktywację obrony przeciwutleniającej, hamowanie stanu zapalnego, poprawę funkcji mitochondriów i utrzymanie homeostazy białkowej. Warto zauważyć, że zmiany w tym szlaku związane są z chorobami neurodegeneracyjnymi związanymi z dysfunkcją mitochondriów, w szczególności ataksji Friedreicha. Markery w surowicy związane z odpowiedzią przeciwutleniającą obejmują: peroksydazę glutationową, zmniejszoną glutation (GSH) i utlenioną glutation (GSSG) i metabolizm glutationu (gamma-glutamylocysteiny, restruktuaza glutationu) mierzone w sera przez septrofoto-fluorymetryczne i enzymorskendededededededededededededę) test (ELISA).

Poziomy NFL zostaną ocenione przez zautomatyzowane test immunologiczny Elli. Wyniki uzyskane zarówno u pacjentów z RFC1, jak i kontroli zostaną statystycznie porównywane przez test U Manna Whitneya (statystyki BM SPSS dla Windows, wersja 24.0. Armonk, NY), aby sprawdzić, czy jakiekolwiek biomarkery będą znacznie różne u pacjentów z RFC1, potencjalnie reprezentując biomarker choroby. W przypadku pozytywnych wyników, aby ocenić rolę markera nasilenia choroby, ich poziomy będą skorelowane zarówno z globalnymi, jak i pozycjami skali oceny klinicznej, będące najbardziej wrażliwe wśród badanych w kohorcie. Również ich poziomy w T0 i T1 zostaną porównane u pacjentów z Canvas -RFC1 vs w celu oceny ich potencjalnej roli biomarkera progresji choroby.

Kolejny wtórny cel polega na głębokiej charakterystyce funkcji mitochondriów w fibroblastach pochodzących z pacjenta RFC1 oraz ustanowienie indukowanych linii komórkowych Pruripotencji STEM (IPSC) w przyszłych badaniach Wcześniejsze badania przeprowadzone na tkankach MTDNA w MTDNA w przyszłych badaniach w przyszłych badaniach RFC1 (replikacja MTDNA (Replikacja i Replikacja i/ lub transkrypcja transkrypcji RFC1. i jak dotąd nie przeprowadzono powiązanej wady Oxphos. W tym celu pierwotne fibroblasty pochodzące z pacjentów i kontroli (PF) (8 odrębnych pacjentów z RFC1 i 8 dopasowanych zdrowych kontroli) zostaną analizowane równolegle. Poziomy białka i mRNA RFC1 zostaną określone ilościowo przez odpowiednio za pomocą Western blot (WB) i ilościowego (Q), odpowiednio na białku i RNA wyekstrahowanym z lizatu komórkowego w celu oceny obecności znacznego zmniejszenia poziomów białka RFC1 lub transkryptu między PTS i kontroli płótna.

Badania stresu oksydacyjnego i funkcji mitochondriów: wstępne dane badaczy potwierdzają, że dysfunkcja mitochondriów może odgrywać rolę w patogenezie rfc1-atesji (jak mikroskopia elektronowa ujawniła obecność wyraźnych abnormalizacji mitochondriów w rfc1 (dwie odrębne linie komórkowe).

Aby zweryfikować tę hipotezę, funkcja mitochondrialna zostanie oceniona w RFC1 i kontroluje fibroblasty według różnych podejść:

i) Obecność dysfunkcji mitochondriów jest często związana ze zmianami w dynamice, morfologii i ultrastrukturze mitochondriów. Funkcje te zostaną zbadane za pomocą konfokalnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). W przypadku obrazowania komórek in vivo komórki będą wybarwione Mitotracker Red i Hoechst (sonda jądrowa). Obrazy zostaną następnie przechwycone za pomocą mikroskopu konfokalnego A1, a analiza obrazu zostanie przeprowadzona przy użyciu określonego oprogramowania (Nikon Instruments). Komórki zostaną ocenione w trzy kategorie: nitkowate, pośrednie i rozdrobnione mitochondria. Ultrastruktura mitochondriów zostanie przeanalizowana na sekcjach ultraciennych stałych komórek za pomocą TECNAI G2 (FEI) TEM.

ii) Dysfunkcja mitochondriów może również aktywować mitofagię, w konsekwencji zmniejszy się masę mitochondriów przyczyniającą się do wady energii komórkowej. Masa mitochondriów zostanie oceniona przez immunoblot poryny i Tom20, dwa wskaźniki białek mitochondrialnych masy mitochondrialnej. Jako zmierzona zostanie dodatkowe indeksy, zarówno aktywność syntazy cytrynianowej, mitochondrialny enzym macierzy, przez spektrofotometrię, jak i całkowity numer kopii mtDNA za pomocą QPCR.

iii) Aby podkreślić obecność upośledzonego procesu Oxphos w komórkach RFC1, fibroblasty będą zmuszone do wykorzystania mitochondrialnych oxphos do syntezy ATP poprzez zastąpienie galaktozy glukozy w pożywce hodowlanej. Wejście galaktozy do glikolizy występuje z znacznie niższą szybkością niż glukoza. Tak więc RFC1 i fibroblasty kontrolne będą hodowane w DMEM zawierającym glukozę lub galaktozę jako główny substrat energii do 72 godzin, a wzrost komórek zostanie przeanalizowany. Aby głęboko zbadać OXPHOS, wskaźnik zużycia tlenu będzie mierzony w komórkach cyfrowej permeabilizowanej (OCR) w stanie, stanu 4, stanu 3 i niepopłoniętych warunkach oddechowych oraz maksymalnej szybkości syntezy ATP wrażliwej na oligomycynę. Ponadto, aby zdecydowanie ustalić, czy fibroblasty pacjentów mają niedobór energii, mierzone zostaną wewnątrzkomórkowe poziomy ATP. Wskaźniki oddychania stanu 4 i stanu 3 będą mierzone odpowiednio w przypadku nieobecności i obecności nasycającego ADP, a także oddechu niezdłużonego w obecności fCCP odłączki (karbonylowego cyanid-p-trifluorometoksyfenomodrazonu). Szybkość syntezy ATP złożona I jest mierzona w warunkach oddechowych stanu 3 opisanych powyżej. Zsyntetyzowana zawartość ATP lub stanu ustalonego w komórkach zostanie określona ilościowo metodą luminometryczną.

iv) Dysfunkcja mitochondriów prowadzi do zmian w potencjale błony mitochondrialnej (MMP) i produkcji ROS. Zatem MMP, główny parametr funkcjonalny mitochondriów, zostanie oszacowany w komórkach zarówno metodą mikroskopii fluorescencyjnej, jak i cytometrii przepływowej w celu wykrycia zmian zarówno sieci mitochondrialnej, jak i wewnętrznego potencjału błony mitochondrialnej ψm. ΔMM będzie mierzony przez ładowanie komórek estruem metylowym tetrametylhodaminy (TMRM), sondy lipofilowej, która wchodzi w mitochondria w sposób zależny od δm. Komórki zostaną inkubowane z TMRM przy nieobecności lub obecności oligomycyny, specyficznego inhibitora kompleksu syntazy ATP i pod FCCP. Wiele obrazów fluorescencyjnych o dużej mocy pacjentów i kontroli fibroblasty zostanie uzyskanych za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu oprogramowania IAS2000 (Delta sistemi, Roma, Włochy). Do ilościowej analizy ψm za pomocą cytometrii przepływowej zostanie zastosowany analizator komórek Muse (Millipore, Billerica, MA, USA), stosując przepływające oprogramowanie (Center for Biotechnology, University of Turku). Wszelkie dowody zmian mitochondrialnych zostaną dodatkowo omówione przez immunoblotting kompleksów Oxphos v) równolegle do oceny in vivo, możliwy udział wyższego poziomu ROS i wynikającego z nich stres oksydacyjny komórkowy w patogenezie RFC1 -Anaxia będzie oceniany w hodowanych fibblastach Fibroblastów, pomiar nadmiernie podtlenku anionowego radykalnego (O2 • - - -) MITOROSSYJSJI przez Flubeszalne Probte. Mitosox Czerwony i komórkowy ROS według pomarańczowej sondy fluorescencyjnej Cellrox, przy użyciu cytometru Muse. Aby zbadać, czy zmiany ROS zależą od zmian w systemach obrony przeciwutleniaczy komórek, poziomów i aktywności głównych enzymów przeciwutleniających oraz całkowitego i zmniejszonego poziomu glutationu zostaną ocenione odpowiednio za pomocą immunoblot i spektrofotometrycznych testów.

vi) Odkrycie znaczących zmian mitochondrialnych w fibroblastach RFC1 spowoduje zbadanie ich wymowy wobec śmierci komórkowej wywołanej mitochondrial. Zwiększone ROS indukuje przejście przepuszczalności porów wrażliwych na cyklosporynę w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, co z kolei powoduje obrzęk mitochondriów, a wynikające z tego zakłócenie syntezy ATP i homeostazy jonowej, prowadzące do śmierci komórki. Aktywacja apoptozy będzie oceniana w komórkach pacjentów i kontrolnych w pożywce wzbogaconej w glukozę w różnych momentach. Zmieńca śmierci komórki zostanie oceniona przez Muse Cell Analyzer przy użyciu zestawu do testu Muse i testu żywotności, aneksyny V i zestawu testu Dead Cell oraz zestawu testu kaspazy-3/7.

Jako ostatni dodatkowy cel, w tym badaniu powstanie IPSC. Trzy RFC1 i trzy kontrole linii hodowli PF zostaną indukowane do IPSC, we współpracy/nadzorowaniu z dr J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza. Te iPSC zostaną dodatkowo zróżnicowane w pierwotne neurony proprioceptywne, ponieważ neurony czuciowe nie są one dotknięte u pacjentów z RFC1-Ataksją.