Patogen innsikt og søk etter biomarkører i RFC1-ataksi/lerret (INSIDE-CANVAS)

Forskningsforslaget anerkjenner som det primære målet for å evaluere og sammenligne følsomheten til individuell validert klinisk vurderingsskala for å vurdere global sykdom alvorlighetsgrad og/eller progresjon i en kohort av RFC1-ataksi-pasienter sekundære mål og i) for å identifisere nye potensielle sirkulerende biomarkører i RFC1-ataksi ved å teste et kohort av RFC1-ATAXI-ATAXIa ved å teste et kohort av RFC1-ATAXI-pasienter VS-kontroller av RFC1-ataksen ved å teste et) for å identifisere nye potensielle pasienter. Modeller for å få innsikt om patogenese av RFC1-ataksi, spesielt angående mitokondriell funksjon.

For disse formålene vil en langsgående vurdering av en studiekohort av genetisk bestemte RFC1-ataksi-pasienter (intensjon om å behandle 25 punkter) bli utført.

Basert på involvering av cerebellare og proprioseptive systemer i RFC1-ataksi, er følgende kliniske vurderingsskalaer valgt: skala for vurdering og vurdering av ataksi (SARA), International Cooperative Ataxia Rating Scale (ICARs), Sensory Ataxia Rating Scale (Sears), Berg Balance (ICARs), BBS, Sensory Ataxia Rating Scale (Sears), Berg Balance (ICARs), Sensory Ataxia Rating Scale (Sears), Berg Balance (ICAR), Sensory Ataxia Rating Scale (SEACE ( Vestibulære symptomer vil bli vurdert av svimmelhetshåndteringsbeholdningsspørreskjema (DHI).

For statistisk analyse angående klinisk alvorlighetsgrad, vil også T0 (baseline) RFC1- pasienter gjennomgå:

1) Nevrofysiologiske studier: EMG og nervestudier, motoriske og sensoriske fremkalte potensialer registrert ved de fire lemmene; 2) Vestibulær funksjonsvurdering etter videohodeimpulstest. Innsamlede data vil også omfatte: alder ved begynnelse (AAO) av symptomer, alder ved påmelding (AAE), sykdomsvarighet (DD); tilstedeværelse av uforklarlige hoste og/eller svelgende forstyrrelser; 3T hjerne og ryggmarg MR. Statistisk analyse vil bli utført ved Pearsons korrelasjonstester. Globale og varescore for hver skala vil også være korrelert med DD, funksjonshemmingstadium estimert av Spatax Disability -poengsum (0: Ingen funksjonell handikap, 1: Ingen funksjonell handikap, men tegn ved eksamen, 2: mild, i stand til å løpe, ubegrenset, å gå en gang, 3: Rullestol, 7: begrenset til en seng), og andre store diagnostiske funn som individuelt bidrar til motorisk funksjonshemming (dvs. nevropati, vestibulopati, cerebellar atrofi).

For det andre målet vil blodprøver bli samlet inn fra RFC1-ataksi-kohorten og en kohort av alder og kjønn matchede sunne kontroller som er registrert til dette formålet for vurderingen av et panel av sirkulerende biomarkører av oksidativt stress (OS) og neurofilament lykjede (NFL), på begge t0 (baselinbesøk) og t1 (ett (ett år. Blodprøver vil bli behandlet for å oppnå serum, plasma og RNA. For serumanalyser blir 9 cm blod i vakuett (CAT Serum SEP Clot Activator) rør trukket, sentrifugert innen 1 time, alikvotert i flere 50 UL -alikvoter og lagret ved -80 ° C. For plasmaanalyser vil 9 cm blod bli trukket inn i EDTA -rør, og etter 30 'ved romtemperatur, vil det bli sentrifugert og alikvotert i 50 UL -alikvoter og lagret ved -80 ° C. Til slutt vil venøst ​​blod bli trukket inn i ett 10 ml bd -vakuanerør med EDTA, og total RNA vil bli trukket ut fra leukocytter og omvendt transkribert i cDNA, som vil bli lagret ved -80 ° C. Alle prøvene som samles blir lagret, vil da på slutten av innsamlingsperioden bli sendt og undersøkt samtidig i duplikat for å unngå fryset-tine sykluser, ved bruk av en ekstern tjeneste (laboratorium for molekylær medisin av Bambino Gesù sykehus, vil det oksidative stresset til å omfatte: uttrykk for den transkripsjonsfaktoren NROM ( Time-PCR. NRF2 regulerer mange cytoprotektive veier gjennom aktivering av antioksidantforsvar, hemming av betennelse, forbedring av mitokondriell funksjon og vedlikehold av proteinhomeostase. Det er oppmerksom på at endringer i denne veien har vært assosiert med nevrodegenerative sykdommer assosiert med mitokondriell dysfunksjon, særlig Friedreich ataksi. Serummarkører relatert til antioksidantrespons inkluderer: glutathione peroxidase, redusert glutathione (GSH) og oksidert glutathione (GSSG) og glutathione metabolisme (gamma-glutamcystein-ligase, glutation-mål-mål-en-enzy-enzy-enzy-flutoy-flut-en-gluto-en-gluto-mål-en-gluto-mål-en-glutato-mål-mål-glut. Immunosorbent -analyse (ELISA).

NFL -nivåer vil bli vurdert av Ella Automated Immunoassay. Resultater oppnådd hos både RFC1-pasienter og kontroller vil bli statistisk sammenlignet av Mann Whitney U-test (BM SPSS-statistikk for Windows, versjon 24.0. Armonk, NY) for å teste om noen biomarkører vil være betydelig forskjellig hos RFC1 -pasienter, og dermed potensielt representere en sykdomsbiomarkør. I tilfelle av positive resultater, for å vurdere rollen som en sykdoms alvorlighetsmarkør, vil nivåene deres bli korrelert både med global og varescore for den kliniske vurderingsskalaen som er den mest følsomme blant de som er testet i kohorten. Dessuten vil nivåene deres ved T0 og T1 bli sammenlignet hos lerret -RFC1 -pasienter kontra kontroller, for å evaluere deres potensielle rolle som biomarkør for sykdomsprogresjon.

Et annet sekundært mål består i den dype karakteriseringen av mitokondriell funksjon i RFC1 pasient-avledede fibroblaster, og etablering av induserte pluripotente STEM (IPSC) cellelinjer for fremtidige forskning Tidligere studier utført på lerrets pasienters vev og viste normal) og relatert Oxphos -defekt er ikke utført så langt. Til dette formålet vil pasienter- og kontroll-avledede primære fibroblaster (PF) (8 distinkte RFC1-pasienter og 8 matchede sunne kontroller) bli analysert parallelt. RFC1 -protein- og mRNA -nivåer vil bli kvantifisert gjennom henholdsvis Western blot (WB) og kvantitativ (Q) PCR på total protein og RNA ekstrahert fra cellelysat for å vurdere tilstedeværelsen av noen signifikant reduksjon i RFC1 -protein- eller transkripsnivåer mellom lerret PTS og kontroller.

Studier på oksidativt stress og mitokondriell funksjon: Foreløpige data fra etterforskerne støtter at mitokondriell dysfunksjon kan spille en rolle i patogenesen av RFC1-ataksi, ettersom elektronmikroskopien avslørte tilstedeværelsen av klar mitokondriell abnormalitet i RFC1 pasienter DERIVED FIBROBROBROSROSTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSLASTSINGS (

For å bekrefte denne hypotesen, vil mitokondriell funksjon bli vurdert i RFC1 og kontrollerer fibroblaster ved forskjellige tilnærminger:

i) Tilstedeværelsen av mitokondriell dysfunksjon er ofte assosiert med endringer enten i dynamikk, morfologi og ultrastruktur av mitokondrier. Disse funksjonene vil bli undersøkt ved konfokal og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). For in vivo celleavbildning vil celler bli farget med mitotracker rød og Hoechst (kjernefysisk sonde). Bilder blir deretter tatt opp ved å bruke et A1 -konfokalt mikroskop, og bildeanalyse vil bli utført ved hjelp av en spesifikk programvare (Nikon Instruments). Celler vil bli scoret i tre kategorier: filamentøse, mellomliggende og fragmenterte mitokondrier. Mitokondrier ultrastruktur vil bli analysert på ultratin -faste celler seksjoner av en Tecnai G2 (FEI) TEM.

ii) Mitokondriell dysfunksjon kan også aktivere mitofagi, med påfølgende reduksjon av mitokondriell masse som bidrar til celleenergifeil. Mitokondriell masse vil bli vurdert med immunoblot av porin og TOM20, to mitokondrielle proteinerindeks for mitokondriell masse. Som tilleggsindekser vil både citratsyntaseaktivitet, et mitokondriell matrise -enzym, ved spektrofotometri og total mtDNA -kopienummer med qPCR måles.

iii) For å fremheve tilstedeværelsen av nedsatt OXPHOS -prosess i RFC1 -celler, vil fibroblaster bli tvunget til å bruke mitokondrielle Oxphos for å syntetisere ATP ved å erstatte galaktose til glukose i dyrkingsmedium. Inntreden av galaktose i glykolyse skjer med en betydelig lavere hastighet enn glukose. Så RFC1 og kontrollfibroblaster vil bli dyrket i DMEM som inneholder enten glukose eller galaktose som hovedenergisubstrat i opptil 72 timer, og cellevekst vil bli analysert. For å undersøke Oxphos dypt, vil oksygenforbrukshastigheten bli målt i digitonin-permeabiliserte celler (OCR) under tilstand 4, tilstand 3 og frakoblede luftveisforhold, og den maksimale hastigheten for oligomycin-sensitiv ATP-syntese. I tillegg, for definitivt å fastslå om pasientenes fibroblaster er energemangel, vil intracellulære ATP -nivåer bli målt. Tilstand 4 og tilstand 3 respirasjonshastigheter vil bli målt i fravær og i nærvær av henholdsvis metning ADP, og den frakoblede respirasjonen i nærvær av ukobler FCCP (karbonylcyanid-P-trifluormetoksyfenylhydrazon). Komplekset jeg drevne ATP -syntesehastigheten vil bli målt under tilstanden 3 luftveisforhold beskrevet ovenfor. Det syntetiserte ATP- eller stabil ATP -innholdet i celler vil bli kvantifisert ved en luminometrisk metode.

iv) Mitokondriell dysfunksjon fører til mitokondriell membranpotensial (MMP) endringer og ROS -produksjon. Således vil MMP, en hovedfunksjonell parameter for mitokondrier, bli estimert i celler ved både fluorescensmikroskopi og flytcytometri for å oppdage endringer av både mitokondrialt nettverk og det indre mitokondrielle membranpotensialet ΔψM. ΔψM vil bli målt ved å laste celler med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM), en lipofil sonde som kommer inn i mitokondrier på en ΔψM-avhengig måte. Celler vil bli inkubert med TMRM enten i fravær eller tilstedeværelse av oligomycin, en spesifikk hemmer av ATP -syntasekomplekset, og under FCCP. Flere høyeffektfluorescensbilder av pasienter og kontrollerer fibroblaster vil bli anskaffet ved fluorescens omvendt mikroskop ved bruk av IAS2000-programvare (Delta Sistemi, Roma, Italia). For kvantitativ ΔψM -analyse ved flowcytometri, vil en Muse -celleanalysator (Millipore, Billerica, MA, USA) bli brukt anvendelse av den flytende programvaren (Center for Biotechnology, University of Turku). Eventuelle bevis for mitokondrielle endringer vil bli ytterligere adressert ved immunblotting av Oxphos -komplekser v) parallelt med in vivo -vurdering, mulig bidrag av høyere ROS -nivå og påfølgende cellulær oksidativt stress i patogenesen av RFC1 -ataxi -radescent (nivåer) ved å måle en -ataksi -nivåer av rfoorscent ( Probe mitosox rød, og cellulær ROS -nivå av den cellrox oransje lysstoffrøret, ved bruk av et musecytometer. For å utforske om ROS -endringer avhenger av endringer i antioksidantforsvarssystemene til cellene, nivåene og aktivitetene til de viktigste antioksidantenzymer og totalt og redusert glutation -nivå, vil henholdsvis bli vurdert ved immunoblot og spektrofotometriske analyser.

vi) Funnet av betydelige mitokondrielle endringer i RFC1-fibroblaster vil be om å undersøke deres fremgang til mitokondriell indusert celledød. Økt ROS induserer permeabilitetsovergang av den syklosporinfølsomme porene i den indre mitokondrielle membranen, som igjen forårsaker mitokondrier hevelse og følgelig forstyrrelse av både ATP-syntese og ionhomeostase, noe som fører til celledød. Apoptoseaktivering vil bli vurdert i pasient- og kontrollceller i glukoseanriket-DMEM-medium til forskjellige tider. Pregen til celledød vil bli evaluert av Muse Cell Analyzer ved bruk av Muse Count and Lievability Assay Kit, Annexin V og Dead Cell Assay Kit og Caspase-3/7 Assay Kit.

Som siste tilleggsmål, i denne studien, vil det bli opprettet IPSC -er. Tre RFC1 og tre kontroller PF -kulturlinjer vil bli indusert til IPSC -er, i samarbeid/tilsyn med Dr J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Soffferenza. Disse IPSC vil bli ytterligere differensiert til primære proprioseptive nevroner, da sensoriske nevroner fører ikke påvirket hos RFC1-ataksi-pasienter.