Patogeeniset oivallukset ja etsivät biomarkkereita RFC1-ataksia/kankaalle (INSIDE-CANVAS)

Tutkimusehdotus tunnustetaan ensisijaisena tavoitteena arvioida ja verrata yksittäisten validoitujen kliinisten luokitusasteikkojen herkkyyttä arvioitaessa globaalin sairauksien vakavuuden ja/tai etenemisen RFC1-ataksiapotilaiden toissijaisten tavoitteiden kohortissa I) tunnistamaan RFC1-ataxian uusien potentiaalisten biomarkkereiden tunnistaminen RFC1-ataxia-potilaiden VS-kontrollien ja II) ryhmän tunnistamisessa. Näkemys RFC1-ataksiaan patogeneesistä, etenkin mitokondrioiden toiminnasta.

Näitä tarkoituksia varten suoritetaan geneettisesti määritettyjen RFC1-ataksiapotilaiden (25 pt: n) tutkimuskohortin pitkittäinen arviointi.

Aivo- ja proprioceptiivisten järjestelmien osallistumisen perusteella RFC1-ataksiaan on valittu seuraavat kliinisen luokituksen asteikot: Ataxian (SARA), kansainvälisen osuuskunnan ataksia-asteikon (ICARS), sensorian ataxia-asteikon (SEARS), Berg-tasapainon (BBS) ja Tinetti-arviointityökalun arviointia ja luokitusta. Vestibulaariset oireet arvioidaan huimauksella haittakysely (DHI).

Kliinisen vakavuuden tilastollista analyysiä varten T0 (lähtötilanteessa) RFC1-potilaat käyvät läpi:

1) Neurofysiologiset tutkimukset: EMG- ja hermotutkimukset, motoriset ja aistien aiheuttivat potentiaalit, jotka on tallennettu neljään raajaan; 2) Vestibulaarisen toiminnan arviointi videon pää-impulssitestillä. Kerättyihin tietoihin sisältyy myös: ikä oireiden alkaessa (AAO), ikä ilmoittautumisessa (AAE), taudin kesto (DD); selittämättömien yskä- ja/tai nielemishäiriöiden läsnäolo; 3T aivojen ja selkäytimen MRI. Tilastollinen analyysi suoritetaan Pearsonin korrelaatiotesteillä. Jokaisen asteikon globaalit ja tuotepisteet korreloivat myös DD: n kanssa, vammaisuusvaiheen, joka arvioidaan SpaTax -vammaisuuspisteellä (0: Ei toiminnallista haitta, 1: Ei toiminnallista haitta, mutta merkkejä tutkimuksessa, 2: lievä, kykenevä juoksemattoman kävelyn, 3: maltillinen, kykenemätön juoksemaan, rajoitettu kävely ilman apua, 4: ERÄKEEN, kävely, 5: 5: 7: Rajoitettu sänkyyn) ja muut suuret diagnostiset havainnot, jotka vaikuttavat yksilöllisesti motoriseen vammaisuuteen (ts. Neuropatia, vestibulopatia, pikkuaivojen atrofia).

Toista tavoitetta varten verinäytteet kerätään RFC1-ataksia-kohortista ja ikä- ja sukupuolen kohorttia vastaavat terveelliset kontrollit, jotka on ilmoittautunut tähän tarkoitukseen arvioitaessa hapettavan stressin (OS) ja T1: n (yhden vuoden seurantaa) kiertävien biomarkkereiden (OS) ja T1 (yhden vuoden seurantakäyttöinen) paneelin arviointia. Verinäytteet prosessoidaan seerumin, plasman ja RNA: n saamiseksi. Seerumianalyysejä varten vedetään 9 cm3 veren tyhjiöputkessa (CAT -seerumin sep -hyytymän aktivaattori), sentrifugoitu 1 tunnin sisällä, alikvootia useissa 50 UL -alikvootit ja säilytetään -80 ° C: ssa. Plasma -analyysejä varten 9 cm3 veriä vedetään EDTA -putkiin ja 30 ': n jälkeen huoneenlämpötilassa sentrifugoitiin ja alikvoottiin 50 UL -alikvootissa ja varastoidaan -80 ° C: ssa. Viimeiseksi, laskimoveri vedetään yhteen 10 ml: n BD -vacutainer -putkeen EDTA: lla, ja kokonais -RNA uutetaan leukosyyteistä ja käännetään käänteisesti cDNA: han, jota säilytetään -80 ° C: ssa. Kaikki kerätyt näytteet tallennetaan, sitten keräysjakson lopussa lähetetään ja tutkitaan samanaikaisesti kaksoiskappaleena jäätymis-sulatussyklien välttämiseksi, käyttämällä ulkoista palvelua (bambino gesù -sairaalan molekyylilääketiede) sisältyy: transkriptiotekijän NRF2: n (ydintekijäröintirekoitin 2-arvon tekijän 2) analysointiaika (ydinöintekoritekijä (ydinaarit tekijä elintarsytöysaika-aikakausi). NRF2 säätelee monia sytoprotektiivisia reittejä antioksidanttipuolustuksen aktivoinnin, tulehduksen estämisen, mitokondrioiden toiminnan parantamisen ja proteiinin homeostaasin ylläpitämisen. Huomattakoon, että tämän reitin muutokset on liitetty mitokondriaaliseen toimintahäiriöön liittyviin neurodegeneratiivisiin sairauksiin, erityisesti Friedreich -ataksiaan. Antioksidanttivasteeseen liittyviä seerumimarkkereita ovat: glutationiperoksidaasi, pelkistetty glutationi (GSH) ja hapettunut glutationi (GSSG) ja glutationien metabolismi (gamma-glutamyylisteiiniligaasi, glutationi-reduktaasi), joka on mitattu serfoto-lenkeillä ja EnzyMe-linkeillä Immunosorbenttimääritys (ELISA).

NFL -tasot arvioidaan Ella -automatisoidulla immunomäärityksellä. Mann Whitney U-testi verrataan tilastollisesti sekä RFC1-potilailla ja kontrolleilla saatuja tuloksia (BM SPSS-tilastot Windows-versiolle, versioon 24.0. Armonk, NY) testata, olisiko jokin biomarkkerit merkittävästi erilainen RFC1 -potilailla, mikä mahdollisesti edustaa taudin biomarkkeria. Positiivisten tulosten tapauksessa, jotta voidaan arvioida taudin vakavuusmarkkerina roolia, niiden tasot korreloivat sekä globaalien että kliinisen luokituksen asteikon kohteiden pisteiden kanssa, jotka ovat herkkiä kohortissa testattujen keskuudessa. Lisäksi niiden tasoja T0: lla ja T1: ssä verrataan Canvas -RFC1 -potilailla VS -kontrolleissa, jotta voidaan arvioida heidän potentiaalisen roolinsa sairauden etenemisen biomarkkerina.

Toinen sekundaarinen tavoite koostuu mitokondrioiden toiminnan syvästä karakterisoinnista RFC1-potilaiden johdetuissa fibroblasteissa ja indusoitujen pluripotenttisten STEM (IPSC) -solulinjojen perustamisesta tulevaa tutkimusta varten Aikaisemmat tutkimukset, jotka tehtiin kangaspotilaiden kudoksissa, osoittivat ilmeisesti normaalia proteiinia ja transkriptitasoja RFC1: ssä, kun taas on ovaista RFC1-toiminnassa (ovatkaa tai orjatiivista RFC1-funktiota. ja siihen liittyvää Oxphos -virhettä ei ole toistaiseksi suoritettu. Tätä tarkoitusta varten analysoidaan potilaiden ja kontrolleista johdettuja primaarisia fibroblasteja (PF) (8 erillistä RFC1-potilasta ja 8 vastaavaa tervettä kontrollia). RFC1 -proteiini- ja mRNA -tasot kvantifioidaan Western blot: n (WB) ja kvantitatiivisen (Q) PCR: n avulla, vastaavasti kokonaisproteiinilla ja RNA: lla, joka on uutettu solulysaatista RFC1 -proteiinien tai transkriptitasojen merkittävän vähentymisen läsnäolon kankaalla PTS: n ja kontrollien välillä.

Oksidatiivisen stressin ja mitokondriaalisen toiminnan tutkimukset: Tutkijoiden alustavat tiedot tukevat sitä, että mitokondrioiden toimintahäiriöt saattavat olla roolia RFC1-ataksiaan patogeneesissä, koska elektronimikroskopia paljasti kirkkaiden mitokondrioiden poikkeavuuksien läsnäolon RFC1-potilaiden johdetuissa fibroblasteissa (kaksi erillistä matkapuhelinta).

Tämän hypoteesin varmistamiseksi mitokondriaalinen funktio arvioidaan RFC1: ssä ja kontrolloi fibroblasteja eri lähestymistapojen avulla:

i) Mitokondrioiden toimintahäiriöiden esiintyminen liittyy usein muutoksiin joko mitokondrioiden dynamiikassa, morfologiassa ja ultrastruktuurissa. Nämä ominaisuudet tutkitaan konfokaalisella ja lähetyselektronimikroskopialla (TEM). In vivo -solujen kuvantamisessa solut värjätään MitoTracker Red ja Hoechst (ydinkoetteri). Kuvat otetaan sitten käyttöön käyttämällä A1 -konfokaalimikroskooppia, ja kuvaanalyysi suoritetaan tietyllä ohjelmistolla (Nikon Instruments). Solut pisteytetään kolmeen luokkaan: rihmamahdokkaat, välituotteet ja pirstoutuneet mitokondriot. Mitokondrioiden ultrastruktuuria analysoidaan Ultrathinin kiinteillä solujen leikkeillä Tecnai G2 (FEI) -TEM: llä.

ii) Mitokondrioiden toimintahäiriöt voivat myös aktivoida mitofagiaa, minkä seurauksena mitokondriaalimassa vähenee solun energiavaurioon. Mitokondriaalinen massa arvioidaan poriinin ja TOM20: n immunoblotilla, joka on kaksi mitokondriaalista proteiinia indeksi mitokondriaalisesta massasta. Lisäindekseinä sekä sitraattisyntaasiaktiivisuus, mitokondriaalimatriisentsyymi mitataan spektrofotometrialla ja mtDNA: n kokonaiskopion lukumäärällä QPCR: llä.

iii) Heikentyneen Oxphos -prosessin esiintymisen korostamiseksi RFC1 -soluissa fibroblastit pakotetaan hyödyntämään mitokondriaalisia oksfoja ATP: n syntetisoimiseksi korvaamalla galaktoosi glukoosiksi viljelyalustan. Galaktoosin pääsy glykolyysiin tapahtuu huomattavasti pienemmällä nopeudella kuin glukoosi. Joten RFC1- ja kontrollifibroblastien viljelty DMEM: ssä, joka sisältää joko glukoosia tai galaktoosia pääenergian substraattina jopa 72 tunniksi, ja solujen kasvu analysoidaan. Oxphosin syvästi tutkimiseksi hapenkulutustaso mitataan digitoniinin permeabilisoiduissa soluissa (OCR) tilan 4, tilan 3 ja kytkemättömien hengitysolosuhteiden ja oligomysiiniherkän ATP-synteesin maksimaalisen nopeuden. Lisäksi voidaan ehdottomasti selvittää, mitataanko potilaiden fibroblastit energiapuutteita, mitataan solunsisäiset ATP -tasot. Tilan 4 ja tilan 3 hengitysnopeudet mitataan vastaavasti kyllästyvän ADP: n puuttuessa ja läsnä ollessa ja kytkemättömän hengityksen yhteydessä irrottajan FCCP: n (karbonyylisyanidi-P-trifluorometoksifenyylihydratsoni) läsnä ollessa. Kompleksi I ohjattu ATP -synteesinopeus mitataan edellä kuvattuissa tilan 3 hengitysolosuhteissa. Solujen syntetisoitu ATP- tai vakaan tilan ATP -pitoisuus kvantisoidaan luminometrisellä menetelmällä.

iv) Mitokondrioiden toimintahäiriöt johtavat mitokondrioiden membraanipotentiaalimuutoksiin (MMP) ja ROS -tuotantoon. Siten MMP, mitokondrioiden tärkein funktionaalinen parametri, arvioidaan soluissa sekä fluoresenssimikroskopialla että virtaussytometrialla sekä mitokondriaalisen verkon että mitokondrioiden sisäisen membraanin potentiaalin ΔψM: n muutoksen havaitsemiseksi. A ΔψM mitataan lataamalla solut tetrametyylihodamiinimetyyliesterillä (TMRM), lipofiilinen koetin, joka menee mitokondrioihin A ΔψM-riippuvaisella tavalla. Soluja inkubidaan TMRM: n kanssa joko oligomysiinin puuttuessa tai läsnä ollessa, ATP -syntaasikompleksin spesifinen estäjä ja FCCP: n alla. Potilaiden ja kontrollien fibroblastien useita suuritehoisia fluoresenssikuvia hankitaan fluoresenssin kääntemällä mikroskoopilla käyttämällä IAS2000-ohjelmistoa (Delta Sistemi, Roma, Italia). Kvantitatiivista ΔψM -analyysiä virtaussytometrialla käytetään Muse -soluanalysaattoria (Millipore, Billerica, MA, USA) virtaavan ohjelmiston (Bioteknologian keskus, Turkun yliopisto) soveltamiseen. Mitokondrioiden muutoksia koskevia todisteita käsitellään edelleen oksfoskompleksien immuunipohjaisella immunoblot -kompleksilla rinnalla in vivo -arvioinnissa, korkeamman ROS -tason ja siitä aiheutuvan solujen oksidatiivisen stressin mahdollinen vaikutus RFC1 -ataksiaan patogeneesissä arvioidaan viljellyissä fibroblasteissa, mitattamalla anionin superoksidi radikaalista (O2. Mitosox -punainen ja solujen ROS -taso Cellrox -oranssilla fluoresoivalla koettimella käyttämällä museon sytometriä. Tutkitaan, riippuivatko ROS -muutokset muutoksista solujen antioksidanttien puolustusjärjestelmissä, tärkeimpien antioksidanttientsyymien tasot ja aktiivisuudet ja kokonais- ja vähentynyt glutationitaso arvioidaan vastaavasti immunoblot- ja spektrofotometrisillä määrityksillä.

vi) RFC1-fibroblastien merkittävien mitokondrioiden muutosten havaitseminen kehottaa tutkimaan niiden mielipidettä mitokondrioiden aiheuttamaan solukuolemaan. Lisääntynyt ROS indusoi syklosporiiniherkän huokosen läpäisevyyden siirtymistä mitokondrioiden sisäisessä kalvossa, mikä puolestaan ​​aiheuttaa mitokondrioiden turvotuksen ja siitä johtuvan häiriöt sekä ATP-synteesin että ionin homeostaasin, mikä johtaa solukuolemaan. Apoptoosin aktivaatio arvioidaan potilas- ja kontrollisoluissa glukoosirikastetussa DMEM-väliaineessa eri aikoina. Muse-soluanalysaattori arvioidaan solukuoloon, käyttämällä Muse Comours and Elinbility -määrityssarjaa, Anneksiini V: tä ja Dead Cell Assay Kit -sarjaa ja kaspaasi-3/7-määrityssarjaa.

Viimeisenä lisätavoitteena tässä tutkimuksessa perustetaan IPSC: t. Kolme RFC1: tä ja kolme kontrollia PF -viljelylinjaa indusoidaan IPSC: ksi yhteistyössä/valvonnassa tohtori J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza. Nämä IPSC: n erotetaan edelleen primaarisiksi proprioceptiivisiksi neuroneiksi, koska aistineuronit tuloksena on aina vaikutusta RFC1-ataksiapotilailla.