Ideas patogénicas y búsqueda de biomarcadores en RFC1-Ataxia/lienzo (INSIDE-CANVAS)

The research proposal recognizes as the primary aim to evaluate and compare the sensitivity of individual validated clinical rating scales in assessing global disease severity and/or progression in a cohort of RFC1-ataxia patients Secondary aims are i) to identify novel potential circulating biomarkers in RFC1-ataxia by testing a cohort of RFC1-ataxia patients vs controls and ii) to establish and study patient-derived cell models to Obtenga información sobre la patogénesis de RFC1-ataxia, particularmente en relación con la función mitocondrial.

Para estos fines, se llevará a cabo una evaluación longitudinal de una cohorte de estudio de pacientes con ataxia de RFC1-ataxia genéticamente determinados (intención de tratar 25 pts).

Basado en la participación de los sistemas cerebelosos y propiosceptivos en RFC1-Ataxia, se han seleccionado las siguientes escalas de calificación clínica: Escala para la evaluación y calificación de Ataxia (SARA), Escala Internacional de Calificación de Ataxia Cooperativa (ICARS), Escala de calificación de ATAXIA sensorial (Escala Sears), Berg Balance (BBS) y Herramienta de evaluación Tinetti. Los síntomas vestibulares se evaluarán mediante un cuestionario de inventario de discapacidad mareada (DHI).

Para el análisis estadístico con respecto a la gravedad clínica, en T0 (línea de base) RFC1: los pacientes también se someterán a:

1) Estudios neurofisiológicos: Estudios EMG y nervios, potenciales evocados motores y sensoriales registrados en las cuatro extremidades; 2) Evaluación de la función vestibular mediante prueba de impulso de la cabeza de video. Los datos recopilados también incluirán: edad al inicio (AAO) de síntomas, edad en la inscripción (AAE), duración de la enfermedad (DD); presencia de tos inexplicables y/o perturbaciones de deglución; 3T MRI cerebral y de la médula espinal. El análisis estadístico será realizado por las pruebas de correlación de Pearson. Los puntajes globales y de ítems para cada escala también se correlacionarán con DD, la etapa de discapacidad estimada por el puntaje de discapacidad de Spatax (0: sin discapacidad funcional, 1: sin discapacidad funcional, pero firma en el examen, 2: leve, capaz de correr, caminar ilimitado, 3: moderado, no puede correr, caminar limitado, 4: caminar, caminar con un sticks, 6: 6: 6: inaugural: inaudable a la caminata, una caminata limitada sin ayuda, 4: caminar con una caminata, 5: caminar con dos estacos: 6: inauguración: inaudable a la vista, inaugural, inaudable, una caminata limitada sin ayuda, 4: caminar, caminar con un sticks, 6: 6: inaugural: inaudable a la marcha, un paso a pie, una caminata, sin ayuda. confinado a una cama), y otros hallazgos de diagnóstico importantes que contribuyen individualmente a la discapacidad motora (es decir, neuropatía, vestibulopatía, atrofia cerebelosa).

Para el segundo objetivo, se recolectarán muestras de sangre de la cohorte de ataxia RFC1 y una cohorte de controles saludables de edad y sexo que se matan a este propósito para la evaluación de un panel de biomarcadores circulantes de estrés oxidativo (OS) y cadena ligera de neurofilamentos (NFL), en ambos T0 (visita de base) y T1 (visita de seguimiento de un año). Se procesarán muestras de sangre para obtener suero, plasma y ARN. Para los análisis séricos, se dibujarán 9 cc de sangre en el tubo de vacueta (activador de coágulo SEP de suero CAT), se centrifugará en 1 hora, alícuotas en múltiples 50 alícuotas UL y almacenadas a -80 ° C. Para los análisis de plasma, 9 cc de sangre se dibujarán en tubos EDTA y, después de 30 'a temperatura ambiente, se centrifugarán y se alícuotas en 50 alícuotas UL y se almacenan a -80 ° C. Por último, la sangre venosa se dibujará en un tubo Vacutainer BD de 10 ml con EDTA, y el ARN total se extraerá de los leucocitos y se transcribirá inversamente en ADNc, que se almacenará a -80 ° C. Todas las muestras recolectadas se almacenarán, luego, al final del período de recolección, se enviarán y examinarán simultáneamente por duplicado para evitar los ciclos de congelación, utilizando un servicio externo (Laboratorio de medicina molecular del Hospital Bambino Gesù, Roma) el panel de estrés oxidativo incluirá: expresión del factor de transcripción NRF2 (factor nuclear de factor nuclear 2) analizado por el factor 2) analizado por factor 2) analizado por el factor 2) analizado por el factor 2) analizado por el factor 2) analizado por el factor 2) analizado por el factor 2). Nrf2 regula muchas vías citoprotectivas a través de la activación de las defensas antioxidantes, la inhibición de la inflamación, la mejora de la función mitocondrial y el mantenimiento de la homeostasis proteína. Es de destacar que los cambios en esta vía se han asociado a enfermedades neurodegenerativas asociadas con la disfunción mitocondrial, en particular la ataxia por Friedreich. Los marcadores séricos relacionados con la respuesta antioxidante incluyen: glutatión peroxidasa, glutatión reducido (GSH) y glutatión oxidada (GSSG), y el metabolismo del glutatión (gamma-glutamilcisteína ligasa, glutatión) mided en el serosymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymeymety. Ensayo inmunosorbente (ELISA).

Los niveles de la NFL serán evaluados por el inmunoensayo automatizado de Ella. Los resultados obtenidos en los pacientes y controles de RFC1 se compararán estadísticamente por la prueba U de Mann Whitney (estadísticas de BM SPSS para Windows, versión 24.0. Armonk, NY) para probar si algún biomarcador sería significativamente diferente en los pacientes con RFC1, lo que puede representar un biomarcador de enfermedad. En el caso de los resultados positivos, para evaluar el papel como un marcador de gravedad de la enfermedad, sus niveles se correlacionarán tanto con las puntuaciones globales como de ítems de la escala de calificación clínica, los más sensibles entre los probados en la cohorte. Además, sus niveles en T0 y T1 se compararán en pacientes con Canvas -RFC1 frente a controles, para evaluar su papel potencial como biomarcador de progresión de la enfermedad.

Otro objetivo secundario consiste en la caracterización profunda de la función mitocondrial en los fibroblastos derivados del paciente de RFC1, y el establecimiento de líneas celulares de STEM pluripotentes inducidos (IPSC) para futuros estudios previos previos realizados en los tejidos de los pacientes con lona en los tejidos de los pacientes con MTDA y los niveles de transcripciones normales de RFC1, sin embargo, los estudios que conciernen una función puta de RFC1 en la función de MTDA de MTDAA ANTRATS (MANTATA DE REPRIPTS NORMANTS DE RFC1, sin embargo, estudios que conciernen una función puta de RFC1 en la función de MTDA de MTDAA ANTRA ANTRA ANTERS ANTERS ANTERSA DE RFC1, sin embargo. reparación) y el defecto oxphos relacionado no se ha realizado hasta ahora. Para este propósito, se analizarán en paralelo los fibroblastos primarios derivados de pacientes y controles (8 pacientes distintos de RFC1 y 8 controles sanos coincidentes) en paralelo. Los niveles de proteína y ARNm de RFC1 se cuantificarán a través de la transferencia Western (WB) y la PCR cuantitativa (Q), respectivamente en la proteína total y el ARN extraído del lisado celular para evaluar la presencia de cualquier reducción significativa en los niveles de proteína RFC1 o transcripción entre los PT y los controles de Canvas.

Estudios sobre el estrés oxidativo y la función mitocondrial: los datos preliminares de los investigadores respaldan que la disfunción mitocondrial podría desempeñar un papel en la patogénesis de la ataxia de RFC1, como la microscopía electrónica reveló la presencia de anormalidades mitocondriales claras en las fibroblastos derivadas de los pacientes con RFC1 (dos líneas celulares distintas).

Para verificar esta hipótesis, la función mitocondrial se evaluará en RFC1 y controla los fibroblastos por diferentes enfoques:

i) La presencia de disfunción mitocondrial a menudo se asocia con alteraciones en dinámica, morfología y ultraestructura de mitocondrias. Estas características serán investigadas por microscopía electrónica confocal y de transmisión (TEM). Para las imágenes de células in vivo, las células se tiñeron con Mitotracker Red y Hoechst (sonda nuclear). Las imágenes se capturarán utilizando un microscopio confocal A1, y el análisis de imágenes se realizará utilizando un software específico (Nikon Instruments). Las células se calificarán en tres categorías: mitocondrias filamentosas, intermedias y fragmentadas. La ultraestructura de las mitocondrias se analizará en secciones de células fijas ultrafinas por un TECNI G2 (FEI) TEM.

ii) la disfunción mitocondrial también puede activar la mitofagia, con la consiguiente disminución de la masa mitocondrial que contribuye al defecto de energía celular. La masa mitocondrial se evaluará mediante inmunotransferencia de porina y TOM20, dos proteínas mitocondriales índice de masa mitocondrial. Como índices adicionales, tanto la actividad de citrato sintasa, se medirá una enzima de matriz mitocondrial, por espectrofotometría y el número total de copias de ADNmt por QPCR.

iii) Para resaltar la presencia de un proceso de oxphos deteriorado en las células RFC1, los fibroblastos se verán obligados a utilizar oxphos mitocondriales para sintetizar ATP al sustituir la galactosa a la glucosa en el medio de cultivo. La entrada de galactosa en la glucólisis ocurre a una tasa significativamente más baja que la glucosa. Por lo tanto, los fibroblastos de RFC1 y control se cultivarán en DMEM que contenga glucosa o galactosa como sustrato de energía principal durante hasta 72 h, y se analizará el crecimiento celular. Para investigar profundamente los oxphos, la tasa de consumo de oxígeno se medirá en células permeabilizadas por digitonina (OCR) bajo el estado 4, el estado 3 y las condiciones respiratorias no acopladas, y la tasa máxima de síntesis de ATP sensible a la oligomicina. Además, para establecer definitivamente si los fibroblastos de los pacientes son deficientes en energía, se medirán los niveles intracelulares de ATP. Las tasas de respiración del estado 4 y el estado 3 se medirán en ausencia y en presencia de ADP saturante, respectivamente, y la respiración desacoplada en presencia del FCCP desacoplador (carbonilo cianuro-P-trifluorometoxifenilhidrazona). La tasa de síntesis ATP impulsada por complejo I se medirá bajo las condiciones respiratorias del estado 3 descritas anteriormente. El ATP sintetizado o el contenido de ATP de estado estacionario de las células se cuantificarán por un método luminométrico.

iv) La disfunción mitocondrial conduce a cambios de potencial de membrana mitocondrial (MMP) y la producción de ROS. Por lo tanto, MMP, un parámetro funcional principal de las mitocondrias, se estimará en las células por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo para detectar alteraciones tanto de la red mitocondrial como del potencial de membrana mitocondrial interna Δψm. Δψm se medirá mediante células cargadoras con tetrametilrodamina metilo éster (TMRM), una sonda lipofílica que ingresa a las mitocondrias de una manera dependiente de Δψm. Las células se incubarán con TMRM, ya sea en ausencia o presencia de oligomicina, un inhibidor específico del complejo ATP sintasa y bajo FCCP. Múltiples imágenes de fluorescencia de alta potencia de pacientes y fibroblastos de controles se adquirirán mediante un microscopio invertido de fluorescencia utilizando el software IAS2000 (Delta Sistemi, Roma, Italia). Para el análisis cuantitativo de Δψm por citometría de flujo, se utilizará un analizador de células Muse (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) Aplicando el software de flujo (Centro de Biotecnología, Universidad de Turku). Cualquier evidencia de alteraciones mitocondriales se abordará aún más mediante la inmunotransferencia de los complejos de oxphos v) en paralelo a la evaluación in vivo, la posible contribución de un nivel de ROS más alto y el consiguiente estrés oxidativo celular en la patogénesis de RFC1 -ATaxia será evaluada en los niveles de falsedades cultivados por los fals. Mitosox rojo y nivel de ROS celular por la sonda fluorescente de naranja CellRox, utilizando un citómetro Muse. Para explorar si las alteraciones de ROS dependen de los cambios en los sistemas de defensa antioxidantes de las células, niveles y actividades de las principales enzimas antioxidantes y el nivel de glutatión total y reducido se evaluará mediante ensayos de inmunotransferencia y espectrofotométricos, respectivamente.

vi) El hallazgo de alteraciones mitocondriales significativas en los fibroblastos de RFC1 impulsará investigar su propensión a la muerte celular inducida por mitocondrial. El aumento de ROS induce la transición de permeabilidad del poro sensible a la ciclosporina en la membrana mitocondrial interna, lo que a su vez causa la hinchazón de las mitocondrias y la consiguiente interrupción de la síntesis de ATP y la homeostasis iónica, que conduce a la muerte celular. La activación de la apoptosis se evaluará en las células del paciente y de control en el medio enriquecido con glucosa-DMEM en diferentes momentos. La propensión a la muerte celular será evaluada por el analizador de células de Muse utilizando el kit de ensayo de recuento de muse y viabilidad, anexina V y kit de ensayo de células muertas y kit de ensayo Caspase-3/7.

Como último objetivo adicional, en este estudio, se establecerán IPSC. Se inducirán tres líneas de cultivo PF RFC1 y tres controles en IPSC, en colaboración/supervisión del Dr. J Rosati, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza. Estas IPSC se diferenciarán aún más en las neuronas propioceptivas primarias, ya que las neuronas sensoriales dan como resultado invariablemente afectados en pacientes con RFC1-Ataxia.