Pathogene inzichten en zoeken naar biomarkers in RFC1-ataxie/canvas (INSIDE-CANVAS)

The research proposal recognizes as the primary aim to evaluate and compare the sensitivity of individual validated clinical rating scales in assessing global disease severity and/or progression in a cohort of RFC1-ataxia patients Secondary aims are i) to identify novel potential circulating biomarkers in RFC1-ataxia by testing a cohort of RFC1-ataxia patients vs controls and ii) to establish and study patient-derived Celmodellen om inzicht te krijgen in pathogenese van RFC1-ataxie, met name met betrekking tot mitochondriale functie.

Voor deze doeleinden zal een longitudinale beoordeling van een onderzoekscohort van genetisch bepaald RFC1-ataxie-patiënten (intentie om 25 punten te behandelen) worden uitgevoerd.

Op basis van de betrokkenheid van cerebellaire en proprioceptieve systemen in RFC1-Ataxie zijn de volgende klinische ratingschalen geselecteerd: schaal voor de beoordeling en beoordeling van Ataxia (SARA), International Cooperative Ataxia Rating Scale (ICARS), Sensory Ataxia Rating Scale (SEARS), Berg Balans Scale (BBS), en Tinetti Assessment Tool. Vestibulaire symptomen zullen worden beoordeeld door duizeligheid Handicap Inventory Questionnaire (DHI).

Voor statistische analyse met betrekking tot klinische ernst, zullen RFC1-patiënten bij T0 (baseline) ook ondergaan:

1) Neurofysiologische studies: EMG- en zenuwstudies, motorische en sensorische opgeroepen potentialen geregistreerd op de vier ledematen; 2) Vestibulaire functiebeoordeling door video-hoofd-impuls-test. Verzamelde gegevens omvatten ook: leeftijd bij aanvang (AAO) van symptomen, leeftijd bij inschrijving (AAE), ziekteduur (DD); aanwezigheid van onverklaarbare hoest en/of slikstoornissen; 3T BRAIN EN WERK MRI. Statistische analyse zal worden uitgevoerd door Pearson's correlatietests. Wereldwijde en itemscores voor elke schaal zullen ook worden gecorreleerd met DD, een handicapstadium geschat door de spatax -handicapscore (0: geen functionele handicap, 1: Geen functionele handicap maar tekenen bij examen, 2: mild, in staat om te rennen, onbeperkt lopen, 3: matig, niet in staat om te rennen, beperkt lopen zonder hulp, 4: Severe, Landing met een stokje, 6: Walking met twee: beperkt tot een bed), en andere belangrijke diagnostische bevindingen die individueel bijdragen aan motorische handicap (d.w.z. neuropathie, vestibulopathie, cerebellaire atrofie).

Voor het tweede doel zullen bloedmonsters worden verzameld uit het RFC1-ataxie cohort en een cohort van leeftijd en geslacht passende gezonde controles die aan dit doel zijn ingeschreven voor de beoordeling van een paneel van circulerende biomarkers van oxidatieve stress (OS) en neurofilament lichteten (NFL), bij zowel T0 (baseline bezoek) en T1 (een jaar follow-up bezoek). Bloedmonsters worden verwerkt om serum, plasma en RNA te verkrijgen. Voor serumanalyses wordt 9 cc bloed in vacuette (Cat Serum Sep -stolselactivator) buis getekend, gecentrifugeerd binnen 1 uur, in meerdere 50 ul aliquots en opgeslagen bij -80 ° C. Voor plasma -analyses zal 9 cc bloed worden getrokken in EDTA -buizen en zal na 30 'bij kamertemperatuur worden gecentrifugeerd en opgeheven in 50 UL -hoeveelheden en opgeslagen bij -80 ° C. Ten slotte zal veneus bloed worden getrokken in een BD -vacutainbuis van 10 ml met EDTA, en totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit leukocyten en omgekeerd getranscribeerd in cDNA, die wordt opgeslagen bij -80 ° C. All the samples collected will be stored, then, at the end of the collection period, will be shipped and examined simultaneously in duplicate to avoid freeze-thaw cycles, using an external service (laboratory of Molecular Medicine of the Bambino Gesù Hospital, Rome) The oxidative stress panel will include: expression of the transcription factor NRF2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) analyzed by Real Time-PCR. NRF2 reguleert veel cytoprotectieve routes door de activering van antioxidantafweer, remming van ontsteking, verbetering van de mitochondriale functie en het behoud van eiwithomeostase. Merk op dat veranderingen in deze route zijn geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten geassocieerd met mitochondriale disfunctie, in het bijzonder friedreich ataxie. Serummarkers gerelateerd aan antioxidantrespons zijn onder meer: ​​glutathione peroxidase, verminderde glutathione (GSH) en geoxideerd glutathione (GSSG) en glutathionmetabolisme (gamma-glutamylcysteïne-ligase, glutathione reductase) gemeten door spectropo-fluorimetrische assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-assays en enzym-linke-asterbante Atay gemeten door spectropo-assays en enzym-linke-linke-astay (ELISA).

NFL -niveaus worden beoordeeld door Ella Automated Immunoassay. Resultaten verkregen bij zowel RFC1-patiënten als controles zullen statistisch worden vergeleken door Mann Whitney U-test (BM SPSS-statistieken voor Windows, versie 24.0. Armonk, NY) om te testen of biomarkers aanzienlijk verschillen bij RFC1 -patiënten, waardoor mogelijk een biomarker van de ziekte is. In het geval van positieve resultaten, om de rol als ernstmarker van de ziekte te beoordelen, zullen hun niveaus worden gecorreleerd, zowel met globale als itemscores van de klinische beoordelingsschaal, het meest gevoelig onder degenen die in het cohort worden getest. Ook zullen hun niveaus op T0 en T1 worden vergeleken in canvas -RFC1 -patiënten versus controles, voor het evalueren van hun potentiële rol als biomarker van ziekteprogressie.

Een ander secundair doel bestaat uit de diepe karakterisering van de mitochondriale functie bij van RFC1 van patiënt afgeleide fibroblasten, en de oprichting van geïnduceerde pluripotente stam (IPSC) cellijnen voor toekomstige onderzoeks eerdere studies die zijn uitgevoerd op canvas-weefsels blijkbaar normaal eiwit en transcripten van RFC1, maar studies met betrekking tot RFC1-functie in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna-handel in mtdna. Reparatie) en gerelateerd Oxphos -defect zijn tot nu toe niet uitgevoerd. Hiertoe zullen patiënten en controles afgeleide primaire fibroblasten (PF) (8 verschillende RFC1-patiënten en 8 matched gezonde controles) parallel worden geanalyseerd. RFC1 -eiwit- en mRNA -niveaus zullen worden gekwantificeerd via Western blot (WB) en kwantitatieve (Q) PCR, respectievelijk op totaal eiwit en RNA geëxtraheerd uit cellysaat om de aanwezigheid van een significante vermindering van RFC1 -eiwit of transcriptniveaus tussen canvas -PT's en controles te beoordelen.

Studies naar oxidatieve stress en mitochondriale functie: voorlopige gegevens van de onderzoekers ondersteunen dat mitochondriale disfunctie een rol zou kunnen spelen in de pathogenese van RFC1-ataxie, aangezien de elektronenmicroscopie de aanwezigheid onthulde van duidelijke mitochondriale abnormaliteiten in RFC1-patiënten afgeleide fibroblasten (twee afzonderlijke cellijnen).

Om deze hypothese te verifiëren, zal de mitochondriale functie worden beoordeeld in RFC1 en regelt fibroblasten door verschillende benaderingen:

i) De aanwezigheid van mitochondriale disfunctie wordt vaak geassocieerd met veranderingen in dynamiek, morfologie en ultrastructuur van mitochondria. Deze functies worden onderzocht door confocale en transmissie -elektronenmicroscopie (TEM). Voor in vivo celbeeldvorming zullen cellen worden gekleurd met mitotracker rood en Hoechst (nucleaire sonde). Afbeeldingen worden vervolgens vastgelegd met behulp van een A1 -confocale microscoop en beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van een specifieke software (Nikon Instruments). Cellen worden gescoord in drie categorieën: filamenteuze, tussenliggende en gefragmenteerde mitochondriën. Mitochondria ultrastructuur zal worden geanalyseerd op secties met ultradunne vaste cellen door een Tecnai G2 (Fei) TEM.

ii) Mitochondriale disfunctie kan ook mitofagie activeren, met de daaruit voortvloeiende afname van de mitochondriale massa die bijdraagt ​​aan celergefact. Mitochondriale massa zal worden beoordeeld door immunoblot van porine en Tom20, twee mitochondriale eiwitten -index van mitochondriale massa. Als aanvullende indexen worden beide citraatsynthase -activiteit, een mitochondriaal matrix -enzym, door spectrofotometrie en het totale mtDNA -kopie -nummer door qPCR gemeten.

iii) Om de aanwezigheid van een verminderd oxfosproces in RFC1 -cellen te benadrukken, zullen fibroblasten worden gedwongen om mitochondriale oxfos te gebruiken om ATP te synthetiseren door galactose te vervangen tot glucose in het kwekenmedium. De binnenkomst van galactose in glycolyse vindt plaats met een aanzienlijk lagere snelheid dan glucose. Dus, RFC1 en controle fibroblasten zullen worden gekweekt in DMEM die glucose of galactose bevat als belangrijkste energiesubstraat tot 72 uur, en celgroei zal worden geanalyseerd. Om Oxphos diep te onderzoeken, zal de zuurstofverbruiksnelheid worden gemeten in digitonine-permeabiliseerde cellen (OCR) onder toestand 4, toestand 3 en niet-gekoppelde ademhalingsomstandigheden en de maximale snelheid van oligomycine-gevoelige ATP-synthese. Bovendien zullen om zeker vast te stellen of de fibroblasten van patiënten energiebeperking zijn, intracellulaire ATP -niveaus worden gemeten. Staat 4 en toestand 3 ademhalingspercentages zullen worden gemeten in afwezigheid en in aanwezigheid van respectievelijk verzadigende ADP, en de niet-gekoppelde ademhaling in aanwezigheid van de ontkoppeling FCCP (carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyfenylhydrazon). Het complexe I ATP -synthesesnelheid zal worden gemeten onder de hierboven beschreven status 3 ademhalingsvoorwaarden. Het gesynthetiseerde ATP- of stabiele ATP -gehalte van cellen zal worden gekwantificeerd met een luminometrische methode.

iv) Mitochondriale disfunctie leidt tot mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) veranderingen en ROS -productie. Aldus zal MMP, een hoofdfunctionele parameter van mitochondria, worden geschat in cellen door zowel fluorescentiemicroscopie als flowcytometrie om veranderingen van zowel het mitochondriale netwerk als het binnenste mitochondriale membraanpotentieel Δψm te detecteren. Δψm zal worden gemeten door cellen te laden met tetramethylrhodamine methylester (TMRM), een lipofiele sonde die mitochondria op een Δψm-afhankelijke manier binnenkomt. Cellen zullen worden geïncubeerd met TMRM, hetzij in afwezigheid of aanwezigheid van oligomycine, een specifieke remmer van het ATP -synthasecomplex en onder FCCP. Meerdere krachtige fluorescentiebeelden van patiënten en controles fibroblasten worden verkregen door fluorescentie-omgekeerde microscoop met behulp van IAS2000-software (Delta Sistemi, Roma, Italië). Voor kwantitatieve Δψm -analyse door flowcytometrie zal een Muse Cell Analyzer (Millipore, Billerica, MA, VS) worden gebruikt om de stromende software toe te passen (Center for Biotechnology, University of Turku). Elk bewijs van mitochondriale wijzigingen zal verder worden aangepakt door immunoblotting van oxphos -complexen v) parallel aan in vivo beoordeling, de mogelijke bijdrage van hoger ROS -niveau en daaruit voortvloeiende cellulaire oxidatieve stress in de pathogenese van RFC1 -ataxie wordt geëvalueerd in gekweekte fibroblasten, by the fluores in de boete van de fluores. Mitosox rood en cellulair ROS -niveau door de cellrox oranje fluorescerende sonde, met behulp van een muze cytometer. Om te onderzoeken of ROS -veranderingen afhankelijk zijn van veranderingen in de antioxidantafweersystemen van de cellen, niveaus en activiteiten van de belangrijkste antioxidant -enzymen en totaal en verlaagd glutathionniveau zullen worden beoordeeld door respectievelijk immunoblot en spectrofotometrische testen.

vi) De bevinding van significante mitochondriale veranderingen in RFC1-fibroblasten zal vragen om hun pronenheid te onderzoeken tot door mitochondriale geïnduceerde celdood. Verhoogde ROS induceert de permeabiliteitsovergang van de cyclosporine-gevoelige porie in het binnenste mitochondriale membraan, dat op zijn beurt mitochondria-zwelling en daaruit voortvloeiende verstoring van zowel ATP-synthese als ion-homeostasis veroorzaakt, wat leidt tot celdood. Apoptose-activering zal op verschillende tijdstippen worden beoordeeld in patiënt- en controlecellen in glucose-verrijkt-DMEM-medium. Vrijheid tot celdood zal worden geëvalueerd door de Muse Cell Analyzer met behulp van de Muse Count en Viability Assay Kit, Annexin V en Dead Cell Assay Kit en Caspase-3/7 Assay Kit.

Als laatste aanvullend doel zal IPSCS in deze studie worden vastgesteld. Drie RFC1- en drie bedieningselementen PF -kweeklijnen worden geïnduceerd in IPSC's, in samenwerking/toezicht op Dr J Rosati, IRCCS Casa Sollievo Della Sofferenza. Deze IPSC zal verder worden gedifferentieerd in primaire proprioceptieve neuronen, omdat sensorische neuronen ontstaat steevast worden beïnvloed bij RFC1-Ataxie-patiënten.