Approfondimenti patogeni e ricerca di biomarcatori in RFC1-Ataxia/Canvas (INSIDE-CANVAS)

La proposta di ricerca riconosce come l'obiettivo primario di valutare e confrontare la sensibilità delle scale di valutazione clinica convalidate individuali nella valutazione della gravità e/o della progressione della malattia globale in una coorte di pazienti secondari di RFC1-Atassia. Intuizione sulla patogenesi di RFC1-Atassia, in particolare per quanto riguarda la funzione mitocondriale.

Per questi scopi, verrà effettuata una valutazione longitudinale di una coorte di studio di pazienti con RFC1-atassia determinati geneticamente (intenzione di trattare 25 punti).

Sulla base del coinvolgimento dei sistemi cerebellari e propriocettivi in ​​RFC1-Atassia, sono state selezionate le seguenti scale di valutazione clinica: scala per la valutazione e la valutazione di atassia (SARA), Scala di valutazione di atassia cooperativa internazionale (strumento di valutazione delle citati. I sintomi vestibolari saranno valutati dal questionario sull'inventario degli handicap di vertigini (DHI).

Per l'analisi statistica sulla gravità clinica, ai pazienti RFC1-T0 (basale), si sottopongono anche a:

1) Studi neurofisiologici: studi EMG e nervosi, potenziali evocati motori e sensoriali registrati ai quattro arti; 2) Valutazione della funzione vestibolare mediante test di testa del video. I dati raccolti includeranno anche: età all'insorgenza (AAO) di sintomi, età all'iscrizione (AAE), durata della malattia (DD); presenza di tosse inspiegabile e/o disturbi della deglutizione; MRI 3T CERVELLA E CONTRO DELLA CORRENTA. L'analisi statistica sarà eseguita dai test di correlazione di Pearson. I punteggi globali e degli oggetti per ciascuna scala saranno anche correlati con DD, fase di invalidità stimata dal punteggio di invalidità dello spatax (0: Nessun handicap funzionale, 1: nessun handicap funzionale ma segni all'esame, 2: lieve, in grado di correre, a piedi illimitato, a piedi, a piedi, a piedi, non in grado di correre, non è in grado di correre, a piedi a piedi: 7: non è in grado di andare a piedi, a piedi a piedi, a piedi a piedi, a piedi a piedi, a spostati, a spostamento a piedi, a una vera a piedi, a una rotta, a spostamento di una passeggiata, a beni a piedi, aldotto, aldotto a piedi, aldotto, aldotto a piedi, a un passo di spogliato un letto) e altri importanti risultati diagnostici che contribuiscono individualmente alla disabilità motoria (cioè neuropatia, vestibulopatia, atrofia cerebellare).

Per il secondo obiettivo, i campioni di sangue verranno raccolti dalla coorte RFC1- atassia e una coorte di età e sesso abbinati a controlli sani iscritti a questo scopo per la valutazione di un gruppo di biomarcatori circolanti di stress ossidativo (OS) e catena leggera del neurofilamento (NFL), in entrambe le visite a T0 (visita di base) e T1 (una visita di follow-up). I campioni di sangue verranno elaborati per ottenere siero, plasma e RNA. Per le analisi sieriche, verranno disegnati 9 cc di sangue nella vacanza (cat sier sep cagot attivatore), centrifugato entro 1 ora, aliquotato in più aliquote 50 UL e conservato a -80 ° C. Per le analisi del plasma, 9 cc di sangue verranno disegnati in tubi EDTA e, dopo 30 'a temperatura ambiente, saranno centrifugati e aliquotati in 50 aliquote UL e conservate a -80 ° C. Infine, il sangue venoso verrà disegnato in un tubo di vuoto BD da 10 ml con EDTA e l'RNA totale verrà estratto dai leucociti e trascritto inverso in cDNA, che verrà immagazzinato a -80 ° C. Tutti i campioni raccolti verranno archiviati, quindi, alla fine del periodo di raccolta, verranno spediti ed esaminati simultaneamente in duplicato per evitare cicli di congelamento-scongelamento, usando un servizio esterno (laboratorio di medicina molecolare del fattore di Bambino Gesù 2) analizzati per il fattore di timeof. Nrf2 regola molti percorsi citoprotettivi attraverso l'attivazione delle difese antiossidanti, l'inibizione dell'infiammazione, il miglioramento della funzione mitocondriale e il mantenimento dell'omeostasi proteica. Da notare che i cambiamenti in questo percorso sono stati associati alle malattie neurodegenerative associate alla disfunzione mitocondriale, in particolare atassia di Friedreich. I marcatori sierici correlati alla risposta antiossidante includono: glutatione perossidasi, glutatione ridotto (GSH) e glutatione ossidato (GSSG) e metabolismo del glutatione (gamma-gamma-glutamymysteine ​​ligasi, glutatione reductasi) misurato in Sera mediante saggio di gamma-glutamymymetine. Dosaggio immunosorbente (ELISA).

I livelli di NFL saranno valutati da Ella Automated Immunoway. I risultati ottenuti nei pazienti e nei controlli RFC1 saranno statisticamente confrontati da Mann Whitney U-test (BM SPSS Statistics per Windows, versione 24.0. Armonk, NY) per verificare se eventuali biomarcatori sarebbero significativamente diversi nei pazienti con RFC1, rappresentando così potenzialmente un biomarcatore della malattia. In caso di risultati positivi, per valutare il ruolo di marcatore di gravità della malattia, i loro livelli saranno correlati sia con i punteggi globali che quelli della scala di valutazione clinica che sono i più sensibili tra quelli testati nella coorte. Inoltre, i loro livelli a T0 e T1 verranno confrontati nei pazienti CANVAS -RFC1 rispetto ai controlli, per valutare il loro ruolo potenziale di biomarcatore della progressione della malattia.

Un altro obiettivo secondario consiste nella profonda caratterizzazione della funzione mitocondriale nei fibroblasti derivati ​​dal paziente RFC1, e nella creazione di linee cellulari pluripotenti indotte (IPSC) per future ricerche precedenti studi condotti su tessuti di tela mtdna apparentemente replica e replica apparentemente replica e replica apparentemente replica e replica. E finora non sono stati eseguiti i difetti OxPhos correlati. A tal fine, i fibroblasti primari derivati ​​dai pazienti e controlli (PF) (8 pazienti distinti RFC1 e 8 controlli sani abbinati) saranno analizzati in parallelo. I livelli di proteina e mRNA di RFC1 saranno quantificati attraverso Western blot (WB) e PCR quantitativa (Q), rispettivamente sulla proteina totale e l'RNA estratto dal lisato cellulare per valutare la presenza di una riduzione significativa della proteina RFC1 o dei livelli di trascrizione tra PT di tela e controlli.

Studi sullo stress ossidativo e sulla funzione mitocondriale: i dati preliminari degli investigatori supportano che la disfunzione mitocondriale potrebbe svolgere un ruolo nella patogenesi della RFC1-Atassia, poiché la microscopia elettronica ha rivelato la presenza chiare anomalie mitocondriali mitocondriali nei pazienti derivati ​​da RFC1 (due linee cellulari distinte).

Per verificare questa ipotesi, la funzione mitocondriale sarà valutata in RFC1 e controlla i fibroblasti con approcci diversi:

i) La presenza di disfunzione mitocondriale è spesso associata ad alterazioni in dinamica, morfologia e ultrastruttura dei mitocondri. Queste caratteristiche saranno studiate mediante microscopia elettronica confocale e di trasmissione (TEM). Per l'imaging cellulare in vivo, le cellule saranno colorate con mitotracker rosso e hoechst (sonda nucleare). Le immagini verranno quindi catturate utilizzando un microscopio confocale A1 e l'analisi delle immagini verrà eseguita utilizzando un software specifico (Nikon Instruments). Le cellule verranno valutate in tre categorie: mitocondri filamentosi, intermedi e frammentati. L'ultrastruttura di mitocondri verrà analizzata su sezioni di cellule fisse ultrasottili da un TEM Tecnai G2 (FEI).

ii) La disfunzione mitocondriale può anche attivare la mitofagia, con conseguente riduzione della massa mitocondriale che contribuisce al difetto dell'energia cellulare. La massa mitocondriale sarà valutata mediante immunoblot di porin e Tom20, due indici di proteine ​​mitocondriali della massa mitocondriale. Come indici aggiuntivi, saranno misurate sia l'attività della citrato sintasi, un enzima a matrice mitocondriale, per spettrofotometria e il numero di copia totale di mtDNA per qPCR.

iii) Per evidenziare la presenza di un processo di OxPhos compromesso nelle cellule RFC1, i fibroblasti saranno costretti a utilizzare OxPhos mitocondriali per sintetizzare l'ATP sostituendo il galattosio al glucosio nel mezzo di coltura. L'ingresso del galattosio nella glicolisi si verifica a un tasso significativamente più basso rispetto al glucosio. Pertanto, i fibroblasti di RFC1 e di controllo saranno coltivati ​​in DMEM contenenti glucosio o galattosio come substrato di energia principale fino a 72 ore e la crescita cellulare verrà analizzata. Per studiare profondamente OxPhos, il tasso di consumo di ossigeno sarà misurato in cellule permeabilizzate permeabilizzate (OCR) sotto le condizioni respiratorie dello stato 4, stato 3 e non accoppiate e il tasso massimo di sintesi ATP sensibile all'oligomicina. Inoltre, per stabilire sicuramente se i fibroblasti dei pazienti sono carenti di energia, verranno misurati i livelli di ATP intracellulare. I tassi di respirazione dello stato 4 e dello stato 3 saranno misurati in assenza e in presenza di ADP saturante, rispettivamente, e la respirazione disaccoppiata in presenza dell'FCCP disaccoppiatore (carbonile cianuro-P-trifluorometossifenilidrazone). Il complesso tasso di sintesi ATP guidato verrà misurato nelle condizioni respiratorie dello stato 3 sopra descritte. Il contenuto ATP sintetizzato o ATP a stato stazionario delle cellule sarà quantificato con un metodo luminometrico.

iv) La disfunzione mitocondriale porta a cambiamenti di potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e produzione di ROS. Pertanto, MMP, un principale parametro funzionale dei mitocondri, sarà stimato nelle cellule sia dalla microscopia a fluorescenza che dalla citometria a flusso per rilevare alterazioni sia della rete mitocondriale che del potenziale di membrana mitocondriale interiore Δψm. Δψm verrà misurato dal caricamento di cellule con tetrametilrhodamina metil estere (TMRM), una sonda lipofila che entra nei mitocondri in modo dipendente Δψm. Le cellule saranno incubate con TMRM in assenza o presenza di oligomicina, un inibitore specifico del complesso sintasi ATP e sotto FCCP. Molteplici immagini di fluorescenza ad alta potenza di pazienti e controlla i fibroblasti saranno acquisite mediante microscopio invertito a fluorescenza utilizzando il software IAS2000 (Delta Sistemi, Roma, Italia). Per l'analisi quantitativa Δψm mediante citometria a flusso, verrà utilizzato un analizzatore cellulare Muse (Millipore, Billerica, MA, USA) applicando il software a flusso (Center for Biotechnology, Università di Turku). Qualsiasi evidenza di alterazioni mitocondriali sarà ulteriormente affrontata mediante immunoblotting dei complessi di Oxphos V) in parallelo alla valutazione in vivo, il possibile contributo di un livello di ROS più elevato e un conseguente stress ossidativo cellulare nella patogenesi del mitochondor -atassia Mitosox Red e ROS Cellular ROS da parte della sonda fluorescente arancione Cellrox, usando un citometro da Muse. Per esplorare se le alterazioni dei ROS dipendono dai cambiamenti nei sistemi di difesa antiossidante delle cellule, dei livelli e delle attività dei principali enzimi antiossidanti e del livello totale e ridotto di glutatione sarà valutato rispettivamente mediante immunoblot e saggi spettrofotometrici.

VI) La scoperta di significative alterazioni mitocondriali nei fibroblasti RFC1 spingerà a studiare la loro propensione alla morte cellulare indotta da mitocondriale. L'aumento del ROS induce la transizione di permeabilità del poro sensibile alla ciclosporina nella membrana mitocondriale interna, che a sua volta provoca gonfiore dei mitocondri e conseguente interruzione sia della sintesi di ATP che dell'omeostasi ionica, portando alla morte cellulare. L'attivazione dell'apoptosi sarà valutata nei pazienti e controlla le cellule nel mezzo arricchito di glucosio in momenti diversi. La Pronyness to Cell Death sarà valutata dall'analizzatore cellulare Muse utilizzando il kit di test di conteggio e di fattibilità Muse, annessina V e kit di test cellulare morto e kit di dosaggio Caspase-3/7.

Come ultimo obiettivo aggiuntivo, in questo studio, verranno stabiliti iPSC. Tre linee di coltura PF RFC1 e tre controlli saranno indotte in IPSC, in collaborazione/supervisione con la dott.ssa J Rosati, IRCCS CASA SOLVIOVE DELLA SOFFERENZA. Questi IPSC saranno ulteriormente differenziati nei neuroni propriocettivi primari, poiché i neuroni sensoriali derivano invariabilmente colpiti nei pazienti con RFC1-Atassia.