主観的認知機能低下におけるアルツハイマー病の兆候 (SIGN-AL)

1. 序論 アルツハイマー病（AD）の研究と臨床実践は転換点にあります。 ADに対する疾患修飾療法（DMT）が利用可能になるにつれ、神経科医、研究者、医療サービスは、認知障害を有する患者に対する診断評価の予測可能な増加需要に直面することになります。 加えて、神経変性が始まる前に疾患過程を止めるためには、DMTを疾患の最も早期段階で投与すべきであるというコンセンサスがあります。 この理由から、国際的な研究は、ADの最も早期の兆候と考えられ、将来のDMTの最適な対象集団とされる、主観的認知機能低下（SCD）と軽度認知障害（MCI）に焦点を当てています。 しかし、MCIもSCDも非常に一般的で不均質な状態であり、異なる可能性のある経過と多くの潜在的な根本原因があります。 現在認識されている疾患のバイオマーカー（脳MRI、PET神経画像、脳脊髄液[CSF]バイオマーカー）は、アルツハイマー病によるSCDおよびMCIの患者を特定するのに非常に正確ですが、高コスト、アクセスの悪さ、侵襲性のため、大規模な使用は極めて限られています。

   このため、これまでの研究では、人口統計学的、認知的、遺伝的特徴を考慮して認知症のリスクを推定することが提案されてきました。 さらに、血液ベースのバイオマーカーは、一次医療レベルでの評価を可能にする有望なツールと考えられています。 しかし、これらの評価やツールのいずれも単独では、スクリーニングレベルで使用するのに十分な精度を保証することはできません。

2. 研究の目的

我々の目的は以下の通りです：

1. CSFバイオマーカーに基づく生物学的に診断されたADの存在を予測する上で、認知機能低下の最も早期段階における、より革新的で容易にアクセス可能なバイオマーカーの精度を評価すること。
2. 神経心理学的スコアや脳波（EEG）など、この文脈ですでに研究されているが矛盾した結果を生み出している技術の有用性を明らかにすること。
3. 音声記録の自動分析（音声分析）など、この分野にまだ適用されていない新しい分析技術を探求すること。
4. SCD患者におけるADリスクへの遺伝的変異の寄与を評価すること。
5. 機械学習アプローチを用いて、これらの技術から抽出された特徴とデータを組み合わせ、SCD患者におけるADの予測モデルを開発すること。

3. 研究デザイン これは多施設共同、縦断的、低侵襲研究です。 患者は、IRCCSポリクリニコ・サン・ドナートの神経学U.O.C.（以下UO1）およびイタリア・フィレンツェのアジエンダ・オスペダリエロ・ウニヴェルシタリア・カレッジの認知症研究革新センター（CRIDEM）（AOUC、以下UO2）から募集されます。

募集された全患者は以下を受けます：

1. 家族歴および臨床歴の詳細な収集；
2. 言語記録、認知的予備能の推定、抑うつおよび人格特性の評価を含む広範な神経心理学的評価；
3. 安静時脳波記録；
4. 以下の血液バイオマーカーの分析：Aβ42、Aβ40、p-tau181、p-tau217、t-tau、NfLおよびGFAP；
5. 以下の遺伝子の分析：PSEN1、PSEN2、APOE、TREM2、ABCA7、BDNF、HTT；
6. 脳脊髄液（CSF）中のバイオマーカーの分析：Aβ42、Aβ40、p-tauおよびt-tau。

3.1. 研究対象集団

以下の基準を満たす患者を募集します：

1. 年齢≧18歳
2. SCD-I基準4に基づくSCDの臨床診断；
3. 年齢および教育レベルで調整されたミニメンタルステート検査（MMSE）スコアが24より大きい；
4. 日常生活動作（ADL）および手段的日常生活動作（IADL）尺度における正常な機能性。

以下の患者は除外：

a. 頭部外傷の既往歴； b. 進行中の神経学的および/または全身性疾患； c. 精神病、大うつ病、または物質使用障害の症状。

4. 研究手順 4.1. 神経心理学的評価、抑うつ評価、および認知的予備能の推定 詳細な神経心理学的検査は、ベースライン（登録時）およびフォローアップ（2年後）に、IRCCSポリクリニコ・サン・ドナート（UO1から登録された患者の場合）およびAOUカレッジ（UO2から登録された患者の場合）で実施され、以下を含みます：全体的認知機能測定（ミニメンタルステート検査）；言語的および空間的短期・長期記憶、注意、言語、構成プラクシス、実行機能を探る課題；Mazzeoらによって記述された記憶障害の主観的知覚；病前知能およびレクリエーション活動などの認知的予備能の指標；抑うつ症状；日常生活動作における自立度指標；人格特性。

4.2. 言語の記録および前処理 言語記録は、神経変性疾患における失語症スクリーニング（SAND）の絵描写課題中に行われます。 静かで制御された環境で、患者は標準化された手順に従って「サマータイムピクチャー」を描写するよう求められます。 音声記録は専用システムで行われ、サンプリングレート44,100 Hzで、ピーク-1 dBに正規化され、48 kHzにダウンサンプリングされます。 Voice Activity Detection（VAD）webRTCアルゴリズムを使用して音声セグメントを抽出します。

4.3. 脳波記録、前処理、および特徴抽出 安静時脳波データは、IRCCSポリクリニコ・サン・ドナート（UO1から登録された患者の場合）およびAOUカレッジ（イタリア・フィレンツェ）（UO2から登録された患者の場合）で収集されます。 標準21チャンネルシステムを使用します。 脳波記録は、10分間の閉眼から始まり、その後3分間の開眼と3分間の閉眼を交互に2回繰り返します。 分析には閉眼セグメントのみを使用します。

4.4. 生物学的サンプルの収集、取り扱い、および保存 血液サンプルは、サン・ドナートポリクリニック神経科およびカレッジ大学病院神経科で、EDTA入り標準ポリプロピレンチューブ（Sarstedt、ニュンブレヒト、ドイツ）を用いた静脈穿刺により採取されます。 認知機能低下患者の臨床ルーチンとして、腰椎穿刺のインフォームドコンセントを取得後、CSFサンプルは午前8時に、ポリクリニコ・サン・ドナート神経科およびカレッジ大学病院神経科で腰椎穿刺により採取されます。 サンプルは直ちに遠心分離され、分析が行われるまで-80℃で保存されます。 血液サンプルは2回採取されます：最初の臨床評価時（ベースライン収集）および最初の収集から2年後（フォローアップ収集）。

UO1で登録された患者からの生物学的サンプルおよび研究のために収集された関連データは、処理およびその後の保存のために、IRCCSポリクリニコ・サン・ドナートのBioCorバイオバンクに移管されます。 サンプルはBioCorバイオバンクに最大25年間保存されます。

UO2で登録された患者からの生物学的サンプルおよび研究のために収集された関連データは、処理およびその後の保存のために、AOUC神経遺伝学研究所に移管されます。 これらは2時間以内に4℃で1300 rcfで10分間遠心分離され、血漿が分離され、分析まで-80℃で保存されます。

4.5. 血液バイオマーカーの分析 血漿バイオマーカーの分析は、ベースライン時および2年フォローアップ時のサンプルについて、AOUカレッジ神経遺伝学研究所で、Quanterix Corporation（レキシントン、マサチューセッツ州、米国）が提供するヒトサンプル用Simoaキットを用いて、自動Simoa SR-Xプラットフォーム（GBIO、杭州、中国）上で、製造元の指示に従って実施されます。 全サンプルの血漿バイオマーカー濃度は単一ランで測定されます。 品質管理は分析に含められ、サンプルとともにテストされます。 キャリブレーション曲線は、Quanterixが提供する連続希釈キャリブレーター測定によって決定されます。

4.6. CSFバイオマーカーの分析 Aβ42、Aβ40、t-tau、およびp-tauの濃度は、AOUC神経遺伝学研究所で、化学発光酵素免疫測定分析装置（CLEIA）LUMIPULSE G600（フジレビオ、東京、日本）を用いて測定されます。 CSFのカットオフ値は、フジレビオが提供するガイドラインに従って決定されます。

4.7. 遺伝学的分析 遺伝学的分析は、AOUC神経遺伝学研究所で実施されます。

血液サンプルからのDNA抽出には、標準的な自動化手法（QIAcube、QIAGEN）が使用されます。 選択された遺伝子は以下のように分析されます：

• APP、PSEN1、PSEN2：すべてのコード化エクソンおよびイントロン/エクソン境界は、Primer3ソフトウェアで設計されたプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅されます。
• APOE遺伝子型：APOE遺伝子型はHRMAによって調査されます。 DNAシーケンシングによって検証された既知のAPOE遺伝子型を有するサンプルが標準参照として使用されます。

• HTTのCAGリピート伸長：これらは、蛍光標識プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応増幅アッセイによって決定されます。 フラグメントサイズは、「SeqStudio Genetic Analyzer」（サーモフィッシャー）およびGeneMapperバージョン4.0ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）を用いた毛細管電気泳動によって決定されます。 DNAシーケンシングによって長さが確認された一連のHTT CAGアレルがサイズ標準として使用されます。

  5. データ分析

データ分析は以下のステップで構成されます：

1. 記述統計分析
2. 機械学習モデルの訓練とテスト

5.1. 記述統計分析 変数の分布はシャピロ-ウィルク検定を用いて評価されます。 患者群は、それぞれ連続変数、非正規分布連続変数、カテゴリ変数について、平均と標準偏差、中央値と四分位範囲（IQR）、頻度またはパーセンテージ、および95％信頼区間を用いて特徴付けられます。 データの分布に応じて、群間比較にはANOVAまたはノンパラメトリックなクラスカル-ウォリス検定を使用し、数値尺度間の相関を評価するにはピアソンまたはスピアマンの相関係数を使用します。 カテゴリデータの比較にはカイ二乗検定を使用します。 効果量は、正規分布する数値尺度にはコーエンのd、マン・ホイットニーのU検定にはη²、カテゴリデータにはクラメールのV検定を用いて計算されます。

5.2. 機械学習モデルの訓練とテスト 我々は、神経心理学的スコア、認知的予備能の指標、人格特性、脳波特徴、血漿バイオマーカー、および遺伝的変異を含む多モーダル特徴のセットを定義します。 各プロファイル次元の分散に基づいて共通の尺度を定義し、その後、各プロファイル「ベクトル」をバイオマーカープロファイルに関連付ける機械学習アルゴリズムを訓練します。 最初に、標準的な機械学習手順を使用してこの分類を実行します。 別個の一連の分析では、患者のCSFバイオマーカープロファイルを予測するために、多層フィードフォワード人工ニューラルネットワーク（ANN）を訓練する深層学習アプローチに従います。 最高の性能（ROC曲線のAUCによって評価される）を示すモデルがテストセットでテストされ、モデル性能の偏りのない推定値が得られます。

6. サンプルサイズ サンプルAUC値0.8を仮定すると、HanleyとMcNeil（1982）が提案した標準誤差計算方法により、アルツハイマー病群40名（20％）および非アルツハイマー病群160名（80％、AOUカレッジで実施された以前の研究データからの推定パーセンテージ15）で、信頼区間の限界を幅0.173（0.713-0.887）で決定することが可能です。 他の条件が同じであれば、AUC 0.9を仮定すると、信頼区間は0.131（0.834-0.966）となります。 20％のドロップアウトを考慮すると、登録すべき対象者のサンプルは250名となります。