La Firma de la Enfermedad de Alzheimer en el Deterioro Cognitivo Subjetivo (SIGN-AL)

1. INTRODUCCIÓN La investigación y la práctica clínica de la enfermedad de Alzheimer (EA) se encuentran en un punto de inflexión. A medida que las terapias modificadoras de la enfermedad (TME) para la EA están disponibles, neurólogos, investigadores y servicios de salud se enfrentarán a una demanda previsible y creciente de evaluaciones diagnósticas para pacientes con deterioro cognitivo. Además, existe consenso en que las TME deben administrarse en las etapas más tempranas de la enfermedad para detener el proceso patológico antes de que comience la neurodegeneración. Por esta razón, la investigación internacional se centra en el deterioro cognitivo subjetivo (DCS) y el deterioro cognitivo leve (DCL), considerados las manifestaciones más tempranas de la EA y la población objetivo óptima para futuras TME. Sin embargo, tanto el DCL como el DCS son condiciones muy comunes y heterogéneas con diferentes trayectorias posibles y muchas causas subyacentes potenciales. Los biomarcadores reconocidos actualmente para la enfermedad (RM cerebral, neuroimagen PET y biomarcadores en líquido cefalorraquídeo [LCR]) son altamente precisos para identificar pacientes con DCS y DCL debido a la enfermedad de Alzheimer, pero su uso a gran escala está extremadamente limitado debido al alto costo, la baja accesibilidad y la invasividad.

   Por esta razón, estudios previos han sugerido considerar características demográficas, cognitivas y genéticas para estimar el riesgo de demencia. Además, los biomarcadores basados en sangre se consideran herramientas prometedoras para permitir la evaluación a nivel de atención primaria. Sin embargo, ninguna de estas evaluaciones o herramientas por sí sola puede garantizar una precisión suficiente para ser utilizada a nivel de cribado.

2. OBJETIVO DEL ESTUDIO

Nuestro objetivo es:

1. Evaluar la precisión de biomarcadores más innovadores y fácilmente accesibles en las etapas más tempranas del deterioro cognitivo para predecir la presencia de EA diagnosticada biológicamente basada en biomarcadores de LCR.
2. Aclarar la utilidad de técnicas ya estudiadas en este contexto pero que han producido resultados contradictorios, como las puntuaciones neuropsicológicas y la electroencefalografía (EEG).
3. Explorar nuevas técnicas de análisis aún no aplicadas a este campo, como el análisis automatizado de grabaciones de voz (análisis del habla).
4. Evaluar la contribución de variantes genéticas al riesgo de EA en pacientes con DCS.
5. Combinar las características y datos extraídos de estas técnicas utilizando un enfoque de aprendizaje automático para desarrollar un modelo predictivo de EA en pacientes con DCS.

3. DISEÑO DEL ESTUDIO Este es un estudio multicéntrico, longitudinal y de baja intervención. Los pacientes serán reclutados de la U.O.C. de Neurología del IRCCS Policlínico San Donato (en adelante, UO1) y del Centro de Investigación e Innovación en Demencia (CRIDEM) del Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi en Florencia, Italia (AOUC, en adelante, UO2).

Todos los pacientes reclutados se someterán a:

1. recogida exhaustiva de antecedentes familiares y clínicos;
2. evaluación neuropsicológica extensa, incluyendo grabación del lenguaje, estimación de la reserva cognitiva, evaluación de depresión y rasgos de personalidad;
3. registro EEG en estado de reposo;
4. análisis de los siguientes biomarcadores sanguíneos: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL y GFAP;
5. análisis de los siguientes genes: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. análisis de biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR): Aβ42, Aβ40, p-tau y t-tau.

3.1. POBLACIÓN DEL ESTUDIO.

Se reclutarán pacientes que cumplan los siguientes criterios:

1. Edad ≥18 años
2. Diagnóstico clínico de DCS según criterios SCD-I4 ;
3. Puntuación en el Mini-Examen del Estado Mental (MMSE) superior a 24, ajustada por edad y nivel educativo;
4. Funcionalidad normal en las escalas de Actividades de la Vida Diaria (AVD) y Actividades Instrumentales de la Vida Diaria (AIVD).

Pacientes con:

a. Antecedentes de traumatismo craneoencefálico; b. Enfermedad neurológica y/o sistémica en curso; c. Síntomas de psicosis, depresión mayor o trastorno por uso de sustancias.

4. PROCEDIMIENTO DEL ESTUDIO 4.1. EVALUACIÓN NEUROPSICOLÓGICA, EVALUACIÓN DE LA DEPRESIÓN Y ESTIMACIÓN DE LA RESERVA COGNITIVA El examen neuropsicológico exhaustivo se realizará al inicio (inclusión) y en el seguimiento (después de dos años) en el IRCCS Policlínico San Donato (para pacientes reclutados de UO1) y en el AOU Careggi (para pacientes reclutados en UO2) e incluirá: medidas cognitivas globales (Mini Examen del Estado Mental); tareas que exploran la memoria verbal y espacial a corto y largo plazo, atención, lenguaje, praxis constructiva y función ejecutiva; percepción subjetiva de déficits de memoria como se describe por Mazzeo et al.; indicadores de reserva cognitiva como la inteligencia premórbida y las actividades recreativas; síntomas depresivos; índice de independencia en actividades de la vida diaria; rasgos de personalidad.

4.2. GRABACIÓN Y PREPROCESAMIENTO DEL LENGUAJE La grabación del lenguaje ocurrirá durante la tarea de descripción de imágenes del Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). En un entorno silencioso y controlado, se pedirá a los pacientes que describan la "Imagen del Verano" siguiendo un procedimiento estandarizado. La grabación de voz se realizará con un sistema dedicado, con una frecuencia de muestreo de 44.100 Hz, normalizada para alcanzar un pico de -1 dB, y reducida a 48 kHz. Se utilizará el algoritmo de detección de actividad vocal (VAD) webRTC para extraer segmentos de audio.

4.3. REGISTRO EEG, PREPROCESAMIENTO Y EXTRACCIÓN DE CARACTERÍSTICAS Los datos de EEG en reposo se recopilarán en el IRCCS Policlínico San Donato (para pacientes reclutados de UO1) y en el AOU Careggi (Florencia, Italia) (para pacientes reclutados en UO2). Se utilizará el sistema estándar de 21 canales. El registro EEG comenzará con 10 minutos con los ojos cerrados, seguido de alternar 3 minutos con los ojos abiertos y 3 minutos con los ojos cerrados, repetido dos veces. Solo los segmentos con ojos cerrados se utilizarán para el análisis.

4.4. RECOGIDA, MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Las muestras de sangre se recogerán por venopunción en tubos de polipropileno estándar con EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) en la Unidad de Neurología del Policlínico San Donato y la Unidad de Neurología del Hospital Universitario de Careggi. Según la rutina clínica para pacientes con deterioro cognitivo, después de obtener el consentimiento informado para la raquicentesis, las muestras de LCR se recogerán a las 8 a.m. mediante punción lumbar en la Unidad de Neurología del Policlínico San Donato y la Unidad de Neurología del Hospital Universitario de Careggi. Las muestras se centrifugarán inmediatamente y se almacenarán a -80°C hasta que se realice el análisis. Las muestras de sangre se recogerán en dos momentos: en el momento de las primeras evaluaciones clínicas (recogida basal) y dos años después de la primera recogida (recogida de seguimiento).

Las muestras biológicas de pacientes reclutados en UO1 y los datos asociados recogidos para el estudio se transferirán al Biobanco BioCor del IRCCS Policlínico San Donato para su procesamiento y posterior almacenamiento. Las muestras se almacenarán en el Biobanco BioCor hasta por 25 años.

Las muestras biológicas de pacientes reclutados en UO2 y los datos asociados recogidos para el estudio se transferirán al laboratorio de Neurogenética del AOUC para su procesamiento y posterior almacenamiento. Se centrifugarán dentro de las dos horas a 1300 rcf a 4°C durante 10 minutos, y se aislará el plasma y se almacenará a -80°C hasta el análisis.

4.5. ANÁLISIS DE BIOMARCADORES SANGUÍNEOS El análisis de biomarcadores plasmáticos se realizará en las muestras tomadas al inicio y en las muestras de seguimiento a los dos años en el Laboratorio de Neurogenética del AOU Careggi utilizando el kit Simoa para muestras humanas proporcionado por Quanterix Corporation (Lexington, MA, EE. UU.) en la plataforma automatizada Simoa SR-X (GBIO, Hangzhou, China), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de biomarcadores plasmáticos de todas las muestras se medirán en una sola ejecución. Se incluirán controles de calidad en el análisis y se probarán junto con las muestras. Se determinará una curva de calibración mediante mediciones de calibrador diluido en serie proporcionadas por Quanterix.

4.6. ANÁLISIS DE BIOMARCADORES DE LCR Las concentraciones de Aβ42, Aβ40, t-tau y p-tau se medirán en el Laboratorio de Neurogenética del AOUC utilizando un analizador de inmunoensayo enzimático quimioluminiscente (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokio, Japón). Los valores de corte para LCR se determinarán siguiendo las pautas proporcionadas por Fujirebio.

4.7. ANÁLISIS GENÉTICO Los análisis genéticos se realizarán en el Laboratorio de Neurogenética del AOUC.

Se utilizará un método automatizado estándar (QIAcube, QIAGEN) para aislar ADN de muestras de sangre. Los genes seleccionados se analizarán de la siguiente manera:

• APP, PSEN1, PSEN2: Todos los exones codificantes y los límites intrón/exón se amplificarán por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores diseñados con el software Primer3.
• Genotipos APOE: Los genotipos APOE se investigarán mediante HRMA. Se utilizarán muestras con genotipos APOE conocidos validados mediante secuenciación de ADN como referencias estándar.

• Expansiones de repeticiones CAG en HTT: Se determinarán mediante ensayo de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa, utilizando cebadores marcados con fluorescencia. El tamaño del fragmento se determinará por electroforesis capilar utilizando el "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) y el software GeneMapper versión 4.0 (Applied Biosystems). Se utilizará un conjunto de alelos CAG de HTT, cuyas longitudes se confirmarán mediante secuenciación de ADN, como estándar de tamaño.

  5. ANÁLISIS DE DATOS

El análisis de datos consistirá en los siguientes pasos:

1. Análisis estadístico descriptivo
2. Entrenamiento y prueba del modelo de aprendizaje automático

5.1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO La distribución de variables se evaluará utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Los grupos de pacientes se caracterizarán utilizando media y desviación estándar, medianas y rangos intercuartílicos (RIC), frecuencias o porcentajes, e intervalos de confianza del 95% para variables continuas, variables continuas no distribuidas normalmente y variables categóricas, respectivamente. Dependiendo de la distribución de los datos, utilizaremos pruebas ANOVA o no paramétricas de Kruskal-Wallis para comparaciones entre grupos, y el coeficiente de correlación de Pearson o Spearman para evaluar correlaciones entre medidas numéricas. Se utilizarán pruebas de chi-cuadrado para comparar datos categóricos. Los tamaños del efecto se calcularán utilizando la d de Cohen para medidas numéricas distribuidas normalmente, η² para la prueba U de Mann-Whitney y la prueba V de Cramer para datos categóricos.

5.2. ENTRENAMIENTO Y PRUEBA DEL MODELO DE APRENDIZAJE AUTOMÁTICO Definiremos un conjunto de características multimodales que incluyen puntuaciones neuropsicológicas, indicadores de reserva cognitiva, rasgos de personalidad, características de EEG, biomarcadores plasmáticos y variantes genéticas. Se definirá una métrica común basada en la dispersión de cada dimensión del perfil, y luego entrenaremos un algoritmo de aprendizaje automático para asociar cada "vector" de perfil con perfiles de biomarcadores. Inicialmente, realizaremos esta clasificación utilizando procedimientos estándar de aprendizaje automático. En un conjunto separado de análisis, seguiremos un enfoque de aprendizaje profundo entrenando una red neuronal artificial (RNA) multicapa de propagación hacia adelante para predecir los perfiles de biomarcadores de LCR de los pacientes. El modelo con el mejor rendimiento (evaluado por las AUC de las curvas ROC) se probará en el conjunto de prueba para obtener una estimación imparcial del rendimiento del modelo.

6. TAMAÑO MUESTRAL Suponiendo un valor de AUC muestral de 0,8, el método de cálculo del error estándar propuesto por Hanley y McNeil (1982) permitirá determinar los límites del intervalo de confianza, con 40 pacientes en el grupo con enfermedad de Alzheimer (20%) y 160 en el grupo sin (80%, porcentajes estimados a partir de datos de estudios previos realizados en AOU Careggi15), de ancho 0,173 (0,713-0,887). En igualdad de condiciones, suponiendo un AUC de 0,9, el intervalo de confianza será de 0,131 (0,834-0,966). Considerando una tasa de abandono del 20%, la muestra de sujetos a reclutar resulta en 250.