主观认知下降中的阿尔茨海默病标志 (SIGN-AL)

1. 引言 阿尔茨海默病（AD）研究和临床实践正处于一个转折点。 随着AD疾病修饰疗法（DMTs）的逐步可用，神经科医生、研究人员和医疗服务机构将面临可预见的、日益增长的认知障碍患者诊断评估需求。 此外，业界共识认为，应在疾病的最早期阶段施用DMTs，以在神经退行性变开始之前阻止疾病进程。 因此，国际研究正聚焦于主观认知下降（SCD）和轻度认知障碍（MCI），它们被认为是AD的最早期表现，也是未来DMTs的最佳目标人群。 然而，MCI和SCD都是非常常见且异质性的状况，具有不同的可能发展轨迹和多种潜在病因。 目前公认的疾病生物标志物（脑部MRI、PET神经影像学和脑脊液[CSF]生物标志物）在识别由阿尔茨海默病引起的SCD和MCI患者方面具有很高的准确性，但由于成本高、可及性差和侵入性，它们的大规模使用受到极大限制。

   因此，先前的研究建议考虑人口统计学、认知和遗传特征来评估痴呆风险。 此外，基于血液的生物标志物被认为是有望在初级保健层面实现评估的工具。 然而，这些评估或工具单独使用都无法保证足够的准确性以用于筛查层面。

2. 研究目的

我们的目标是：

1. 评估在认知下降最早阶段，更具创新性和更易获取的生物标志物在预测基于CSF生物标志物生物学诊断的AD存在方面的准确性。
2. 阐明已在此背景下研究但产生矛盾结果的技术（如神经心理学评分和脑电图[EEG]）的效用。
3. 探索尚未应用于该领域的新分析技术，例如语音记录的自动分析（语音分析）。
4. 评估遗传变异对SCD患者AD风险的贡献。
5. 使用机器学习方法，结合从这些技术中提取的特征和数据，开发SCD患者的AD预测模型。

3. 研究设计 这是一项多中心、纵向、低干预研究。 患者将从IRCCS Policlinico San Donato的神经科U.O.C.（以下简称UO1）和意大利佛罗伦萨Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi的痴呆研究与创新中心（CRIDEM）（AOUC，以下简称UO2）招募。

所有招募的患者将接受：

1. 深入的家族史和临床史收集；
2. 全面的神经心理学评估，包括语言记录、认知储备估计、抑郁和人格特质评估；
3. 静息态EEG记录；
4. 分析以下血液生物标志物：Aβ42、Aβ40、p-tau181、p-tau217、t-tau、NfL和GFAP；
5. 分析以下基因：PSEN1、PSEN2、APOE、TREM2、ABCA7、BDNF、HTT；
6. 分析脑脊液（CSF）中的生物标志物：Aβ42、Aβ40、p-tau和t-tau。

3.1. 研究人群

将招募符合以下标准的患者：

1. 年龄≥18岁
2. 根据SCD-I标准4进行SCD的临床诊断；
3. 简易精神状态检查（MMSE）评分大于24分，并根据年龄和教育水平进行调整；
4. 日常生活活动能力（ADL）和工具性日常生活活动能力（IADL）量表功能正常。

排除有以下情况的患者：

a. 头部外伤史； b. 正在进行的神经性和/或全身性疾病； c. 精神病、重度抑郁或物质使用障碍症状。

4. 研究程序 4.1. 神经心理学评估、抑郁评估和认知储备估计 深入的神经心理学检查将在基线（入组时）和随访时（两年后）在IRCCS Policlinico San Donato（针对从UO1招募的患者）和AOU Careggi（针对在UO2招募的患者）进行，内容包括：整体认知测量（简易精神状态检查）；探索语言和空间短期及长期记忆、注意力、语言、建构性运用能力和执行功能的任务；如Mazzeo等人所述的主观记忆缺陷感知；认知储备指标，如病前智力和娱乐活动；抑郁症状；日常生活活动独立性指数；人格特质。

4.2. 语言记录与预处理 语言记录将在神经退行性疾病失语筛查（SAND）图片描述任务中进行。 在安静可控的环境中，患者将被要求按照标准化程序描述“夏季图片”。 语音记录将使用专用系统进行，采样率为44,100 Hz，归一化至峰值-1 dB，并降至48 kHz。 将使用语音活动检测（VAD）webRTC算法提取音频片段。

4.3. EEG记录、预处理和特征提取 静息EEG数据将在IRCCS Policlinico San Donato（针对从UO1招募的患者）和AOU Careggi（意大利佛罗伦萨）（针对在UO2招募的患者）收集。 将使用标准的21通道系统。 EEG记录将以闭眼10分钟开始，随后交替进行睁眼3分钟和闭眼3分钟，重复两次。 仅闭眼片段将用于分析。

4.4. 生物样本的收集、处理和储存 血液样本将通过静脉穿刺，在San Donato综合医院神经科和Careggi大学医院神经科，使用含EDTA的标准聚丙烯管（Sarstedt，德国Nümbrecht）收集。 作为认知下降患者的临床常规，在获得腰椎穿刺知情同意后，CSF样本将于上午8点在Policlinico San Donato神经科和Careggi大学医院神经科通过腰椎穿刺收集。 样本将立即离心并储存在-80°C直至进行分析。 血液样本将在两个时间点收集：第一次临床评估时（基线收集）和首次收集后两年（随访收集）。

从UO1招募的患者生物样本及为研究收集的相关数据将转移至IRCCS Policlinico San Donato的BioCor生物库进行处理和后续储存。 样本将在BioCor生物库储存长达25年。

从UO2招募的患者生物样本及为研究收集的相关数据将转移至AOUC神经遗传学实验室进行处理和后续储存。 样本将在两小时内在4°C下以1300 rcf离心10分钟，分离血浆并储存在-80°C直至分析。

4.5. 血液生物标志物分析 血浆生物标志物分析将在AOU Careggi神经遗传学实验室，使用Quanterix公司（美国马萨诸塞州列克星敦）提供的人样本Simoa试剂盒，在自动Simoa SR-X平台（GBIO，中国杭州）上，按照制造商说明，对基线样本和两年随访样本进行。 所有样本的血浆生物标志物浓度将在单次运行中测量。 分析中将包含质量控制品并与样本一同测试。 校准曲线将通过Quanterix提供的连续稀释校准品测量来确定。

4.6. CSF生物标志物分析 Aβ42、Aβ40、t-tau和p-tau的浓度将在AOUC神经遗传学实验室使用化学发光酶免疫分析仪（CLEIA）LUMIPULSE G600（Fujirebio，日本东京）进行测量。 CSF的临界值将遵循Fujirebio提供的指南确定。

4.7. 遗传分析 遗传分析将在AOUC神经遗传学实验室进行。

将使用标准自动化方法（QIAcube，QIAGEN）从血液样本中分离DNA。 所选基因将按如下方式进行分析：

• APP、PSEN1、PSEN2：所有编码外显子和内含子/外显子边界将通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，使用Primer3软件设计的引物。
• APOE基因型：APOE基因型将通过HRMA进行研究。 将使用已知APOE基因型并经DNA测序验证的样本作为标准参考。

• HTT中的CAG重复扩增：将通过聚合酶链式反应扩增测定法确定，使用荧光标记引物。 片段大小将通过毛细管电泳，使用“SeqStudio Genetic Analyzer”（ThermoFisher）和GeneMapper 4.0版软件（Applied Biosystems）确定。 一组HTT CAG等位基因，其长度将通过DNA测序确认，将用作大小标准。

  5. 数据分析

数据分析将包括以下步骤：

1. 描述性统计分析
2. 机器学习模型的训练与测试

5.1. 描述性统计分析 变量的分布将使用Shapiro-Wilk检验进行评估。 患者组将分别使用均值和标准差、中位数和四分位距（IQRs）、频率或百分比以及95%置信区间来表征连续变量、非正态分布的连续变量和分类变量。 根据数据分布，我们将使用ANOVA或非参数Kruskal-Wallis检验进行组间比较，并使用Pearson或Spearman相关系数评估数值测量之间的相关性。 卡方检验将用于比较分类数据。 效应大小将使用Cohen's d（针对正态分布的数值测量）、η²（针对Mann-Whitney U检验）和Cramer's V检验（针对分类数据）进行计算。

5.2. 机器学习模型的训练与测试 我们将定义一组多模态特征，包括神经心理学评分、认知储备指标、人格特质、EEG特征、血浆生物标志物和遗传变异。 将基于每个特征维度的离散度定义一个通用度量，然后我们将训练一个机器学习算法，将每个特征“向量”与生物标志物谱相关联。 最初，我们将使用标准机器学习程序执行此分类。 在一组单独的分析中，我们将采用深度学习方法，训练一个多层前馈人工神经网络（ANN）来预测患者的CSF生物标志物谱。 性能最佳的模型（通过ROC曲线的AUC评估）将在测试集上进行测试，以获得模型性能的无偏估计。

6. 样本量 假设样本AUC值为0.8，采用Hanley和McNeil（1982）提出的标准误计算方法，在阿尔茨海默病组40名患者（20%）和非阿尔茨海默病组160名患者（80%，百分比基于先前在AOU Careggi进行的研究数据15估计）的情况下，可确定置信区间宽度为0.173（0.713-0.887）。 在其他条件相同的情况下，假设AUC为0.9，置信区间将为0.131（0.834-0.966）。 考虑到20%的脱落率，需招募的受试者样本量为250。