A Assinatura da Doença de Alzheimer no Declínio Cognitivo Subjetivo (SIGN-AL)

1. INTRODUÇÃO A investigação e a prática clínica da doença de Alzheimer (DA) encontram-se num ponto de viragem. À medida que as terapias modificadoras da doença (TMD) para a DA se tornam disponíveis, os neurologistas, investigadores e serviços de saúde irão enfrentar uma procura previsível e crescente de avaliações diagnósticas para doentes com défice cognitivo. Além disso, existe um consenso de que as TMD devem ser administradas nas fases mais precoces da doença para travar o processo patológico antes do início da neurodegenerescência. Por esta razão, a investigação internacional está a focar-se no declínio cognitivo subjectivo (DCS) e na perturbação cognitiva ligeira (PCL), consideradas as manifestações mais precoces da DA e a população-alvo ideal para futuras TMD. No entanto, tanto a PCL como o DCS são condições muito comuns e heterogéneas, com diferentes trajectórias possíveis e muitas causas subjacentes potenciais. Os biomarcadores actualmente reconhecidos para a doença (ressonância magnética cerebral, neuroimagem por PET e biomarcadores do líquido cefalorraquidiano [LCR]) são altamente precisos na identificação de doentes com DCS e PCL devido à doença de Alzheimer, mas a sua utilização em larga escala é extremamente limitada devido ao elevado custo, à fraca acessibilidade e à sua natureza invasiva.

   Por esta razão, estudos anteriores sugeriram considerar características demográficas, cognitivas e genéticas para estimar o risco de demência. Além disso, os biomarcadores baseados no sangue são considerados ferramentas promissoras para permitir a avaliação ao nível dos cuidados de saúde primários. No entanto, nenhuma destas avaliações ou ferramentas isoladamente pode garantir precisão suficiente para ser utilizada ao nível do rastreio.

2. OBJECTIVO DO ESTUDO

Pretendemos:

1. Avaliar a precisão de biomarcadores mais inovadores e facilmente acessíveis nas fases mais precoces do declínio cognitivo na previsão da presença de DA diagnosticada biologicamente com base em biomarcadores do LCR.
2. Esclarecer a utilidade de técnicas já estudadas neste contexto, mas que produziram resultados contraditórios, como os scores neuropsicológicos e a electroencefalografia (EEG).
3. Explorar novas técnicas de análise ainda não aplicadas a este campo, como a análise automatizada da gravação da fala (análise da fala).
4. Avaliar a contribuição de variantes genéticas para o risco de DA em doentes com DCS.
5. Combinar as características e dados extraídos destas técnicas utilizando uma abordagem de aprendizagem automática para desenvolver um modelo preditivo de DA em doentes com DCS.

3. DESENHO DO ESTUDO Este é um estudo multicêntrico, longitudinal e de baixa intervenção. Os doentes serão recrutados na U.O.C. de Neurologia do IRCCS Policlinico San Donato (doravante designada UO1) e no Centro de Investigação e Inovação em Demência (CRIDEM) da Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi em Florença, Itália (AOUC, doravante designada UO2).

Todos os doentes recrutados serão submetidos a:

1. recolha aprofundada da história familiar e clínica;
2. avaliação neuropsicológica extensa, incluindo gravação da linguagem, estimativa da reserva cognitiva, avaliação da depressão e traços de personalidade;
3. registo de EEG em estado de repouso;
4. análise dos seguintes biomarcadores sanguíneos: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL e GFAP;
5. análise dos seguintes genes: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. análise de biomarcadores no líquido cefalorraquidiano (LCR): Aβ42, Aβ40, p-tau e t-tau.

3.1. POPULAÇÃO DO ESTUDO.

Serão recrutados doentes que cumpram os seguintes critérios:

1. Idade ≥18 anos
2. Diagnóstico clínico de DCS de acordo com os critérios SCD-I4;
3. Pontuação no Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) superior a 24, ajustada para a idade e nível de escolaridade;
4. Funcionalidade normal nas escalas de Actividades de Vida Diária (AVD) e Actividades Instrumentais de Vida Diária (AIVD).

Doentes com:

a. Antecedentes de traumatismo craniano; b. Doença neurológica e/ou sistémica em curso; c. Sintomas de psicose, depressão maior ou perturbação por uso de substâncias.

4. PROCEDIMENTO DO ESTUDO 4.1. AVALIAÇÃO NEUROPSICOLÓGICA, AVALIAÇÃO DA DEPRESSÃO E ESTIMATIVA DA RESERVA COGNITIVA O exame neuropsicológico aprofundado será realizado na linha de base (inclusão) e no seguimento (após dois anos) no IRCCS Policlinico San Donato (para doentes recrutados na UO1) e na AOU Careggi (para doentes recrutados na UO2) e incluirá: medidas cognitivas globais (Mini Exame do Estado Mental); tarefas que exploram a memória verbal e espacial a curto e longo prazo, atenção, linguagem, práxis construtiva e função executiva; percepção subjectiva dos défices de memória conforme descrito por Mazzeo et al.; indicadores de reserva cognitiva, como inteligência pré-mórbida e actividades recreativas; sintomas depressivos; índice de independência nas actividades de vida diária; traços de personalidade.

4.2. GRAVAÇÃO E PRÉ-PROCESSAMENTO DA LINGUAGEM A gravação da linguagem ocorrerá durante a tarefa de descrição de imagens do Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). Num ambiente silencioso e controlado, será pedido aos doentes que descrevam a "Imagem do Verão" seguindo um procedimento padronizado. A gravação de voz será feita com um sistema dedicado, com uma taxa de amostragem de 44.100 Hz, normalizada para atingir um pico de -1 dB, e reduzida para 48 kHz. O algoritmo de Detecção de Actividade Vocal (VAD) webRTC será utilizado para extrair segmentos de áudio.

4.3. REGISTO EEG, PRÉ-PROCESSAMENTO E EXTRAÇÃO DE CARACTERÍSTICAS Os dados de EEG em repouso serão recolhidos no IRCCS Policlinico San Donato (para doentes recrutados na UO1) e na AOU Careggi (Florença, Itália) (para doentes recrutados na UO2). Será utilizado o sistema padrão de 21 canais. O registo de EEG começará com 10 minutos com os olhos fechados, seguido de alternância de 3 minutos com os olhos abertos e 3 minutos com os olhos fechados, repetido duas vezes. Apenas os segmentos de olhos fechados serão utilizados para análise.

4.4. RECOLHA, MANUSEAMENTO E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS As amostras de sangue serão recolhidas por venopunção em tubos de polipropileno padrão com EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Alemanha) na Unidade de Neurologia do Policlínico San Donato e na Unidade de Neurologia do Hospital Universitário de Careggi. De acordo com a rotina clínica para doentes com declínio cognitivo, após obtenção do consentimento informado para raquicentese, as amostras de LCR serão recolhidas às 8 horas por punção lombar na Unidade de Neurologia do Policlínico San Donato e na Unidade de Neurologia do Hospital Universitário de Careggi. As amostras serão imediatamente centrifugadas e armazenadas a -80°C até à realização da análise. As amostras de sangue serão recolhidas em dois momentos: no momento das primeiras avaliações clínicas (recolha de base) e dois anos após a primeira recolha (recolha de seguimento).

As amostras biológicas dos doentes recrutados na UO1 e os dados associados recolhidos para o estudo serão transferidos para o Biobanco BioCor do IRCCS Policlinico San Donato para processamento e armazenamento subsequente. As amostras serão armazenadas no Biobanco BioCor por até 25 anos.

As amostras biológicas dos doentes recrutados na UO2 e os dados associados recolhidos para o estudo serão transferidos para o laboratório de Neurogenética da AOUC para processamento e armazenamento subsequente. Serão centrifugadas no prazo de duas horas a 1300 rcf a 4°C durante 10 minutos, e o plasma será isolado e armazenado a -80°C até à análise.

4.5. ANÁLISE DE BIOMARCADORES SANGUÍNEOS A análise dos biomarcadores plasmáticos será realizada nas amostras colhidas na linha de base e nas amostras de seguimento de dois anos no Laboratório de Neurogenética da AOU Careggi, utilizando o kit Simoa para amostras humanas fornecido pela Quanterix Corporation (Lexington, MA, EUA) na plataforma automatizada Simoa SR-X (GBIO, Hangzhou, China), seguindo as instruções do fabricante. As concentrações dos biomarcadores plasmáticos de todas as amostras serão medidas numa única execução. Controlos de qualidade serão incluídos na análise e testados em conjunto com as amostras. Uma curva de calibração será determinada por medições de calibrador diluído em série fornecidas pela Quanterix.

4.6. ANÁLISE DE BIOMARCADORES DO LCR As concentrações de Aβ42, Aβ40, t-tau e p-tau serão medidas no Laboratório de Neurogenética da AOUC utilizando um analisador de imunoensaio enzimático quimioluminescente (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tóquio, Japão). Os valores de corte para o LCR serão determinados seguindo as directrizes fornecidas pela Fujirebio.

4.7. ANÁLISE GENÉTICA As análises genéticas serão realizadas no Laboratório de Neurogenética da AOUC.

Será utilizado um método automatizado padrão (QIAcube, QIAGEN) para isolar o DNA das amostras de sangue. Os genes seleccionados serão analisados da seguinte forma:

• APP, PSEN1, PSEN2: Todos os exões codificantes e as fronteiras intrão/exão serão amplificados por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers desenhados com o software Primer3.
• Genótipos APOE: Os genótipos APOE serão investigados por HRMA. Amostras com genótipos APOE conhecidos validados por sequenciação de DNA serão utilizadas como referências padrão.

• Expansões de repetições CAG no HTT: Serão determinadas por ensaio de amplificação por reacção em cadeia da polimerase, utilizando primers marcados com fluorescência. O tamanho do fragmento será determinado por electroforese capilar utilizando o "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) e o software GeneMapper versão 4.0 (Applied Biosystems). Um conjunto de alelos CAG do HTT, cujos comprimentos serão confirmados por sequenciação de DNA, será utilizado como padrão de tamanho.

  5. ANÁLISE DE DADOS

A análise de dados consistirá nos seguintes passos:

1. Análise estatística descritiva
2. Treino e teste do modelo de aprendizagem automática

5.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA DESCRITIVA A distribuição das variáveis será avaliada utilizando o teste de Shapiro-Wilk. Os grupos de doentes serão caracterizados utilizando média e desvio padrão, medianas e intervalos interquartis (IIQ), frequências ou percentagens e intervalos de confiança a 95% para variáveis contínuas, variáveis contínuas com distribuição não normal e variáveis categóricas, respectivamente. Dependendo da distribuição dos dados, utilizaremos testes ANOVA ou não paramétricos de Kruskal-Wallis para comparações entre grupos, e o coeficiente de correlação de Pearson ou de Spearman para avaliar correlações entre medidas numéricas. Testes do qui-quadrado serão utilizados para comparar dados categóricos. Os tamanhos do efeito serão calculados utilizando o d de Cohen para medidas numéricas com distribuição normal, η² para o teste U de Mann-Whitney e o teste V de Cramer para dados categóricos.

5.2. TREINO E TESTE DO MODELO DE APRENDIZAGEM AUTOMÁTICA Definiremos um conjunto de características multimodais incluindo scores neuropsicológicos, indicadores de reserva cognitiva, traços de personalidade, características do EEG, biomarcadores plasmáticos e variantes genéticas. Será definida uma métrica comum com base na dispersão de cada dimensão do perfil, e depois treinaremos um algoritmo de aprendizagem automática para associar cada "vector" de perfil com os perfis de biomarcadores. Inicialmente, realizaremos esta classificação utilizando procedimentos padrão de aprendizagem automática. Num conjunto separado de análises, seguiremos uma abordagem de aprendizagem profunda, treinando uma rede neuronal artificial (RNA) de alimentação directa multi-nível para prever os perfis de biomarcadores do LCR dos doentes. O modelo com melhor desempenho (avaliado pelas AUCs das curvas ROC) será testado no conjunto de teste para obter uma estimativa imparcial do desempenho do modelo.

6. DIMENSÃO DA AMOSTRA Assumindo um valor de AUC da amostra de 0,8, o método de cálculo do erro padrão proposto por Hanley e McNeil (1982) permitirá determinar os limites do intervalo de confiança, com 40 doentes no grupo com doença de Alzheimer (20%) e 160 no grupo sem (80%, percentagens estimadas a partir de dados de estudos anteriores realizados na AOU Careggi15), de largura de 0,173 (0,713-0,887). Tudo o resto constante, assumindo uma AUC de 0,9, o intervalo de confiança será de 0,131 (0,834-0,966). Considerando uma taxa de abandono de 20%, a amostra de sujeitos a recrutar resulta em 250.