Sygnatura choroby Alzheimera w subiektywnym spadku funkcji poznawczych (SIGN-AL)

1. WPROWADZENIE Badania nad chorobą Alzheimera (AD) i praktyka kliniczna znajdują się w punkcie zwrotnym. W miarę jak stają się dostępne terapie modyfikujące przebieg choroby (DMTs) dla AD, neurolodzy, badacze i służby zdrowia będą musieli sprostać przewidywalnemu, rosnącemu zapotrzebowaniu na diagnostykę pacjentów z zaburzeniami poznawczymi. Ponadto istnieje konsensus, że DMTs powinny być podawane we wczesnych stadiach choroby, aby zatrzymać proces chorobowy, zanim rozpocznie się neurodegeneracja. Z tego powodu międzynarodowe badania koncentrują się na subiektywnym pogorszeniu funkcji poznawczych (SCD) i łagodnych zaburzeniach poznawczych (MCI), uważanych za najwcześniejsze przejawy AD i optymalną populację docelową dla przyszłych DMTs. Jednak zarówno MCI, jak i SCD są bardzo częstymi i heterogenicznymi stanami o różnych możliwych trajektoriach i wielu potencjalnych przyczynach. Obecnie uznane biomarkery choroby (MRI mózgu, PET neuroobrazowanie i biomarkery płynu mózgowo-rdzeniowego [CSF]) są wysoce dokładne w identyfikacji pacjentów z SCD i MCI spowodowanymi chorobą Alzheimera, ale ich szeroko zakrojone zastosowanie jest niezwykle ograniczone ze względu na wysokie koszty, słabą dostępność i inwazyjność.

   Z tego powodu wcześniejsze badania sugerowały rozważenie cech demograficznych, poznawczych i genetycznych do oszacowania ryzyka demencji. Ponadto biomarkery oparte na krwi są uważane za obiecujące narzędzia umożliwiające ocenę na poziomie podstawowej opieki zdrowotnej. Jednak żadna z tych ocen ani narzędzi sama w sobie nie może zagwarantować wystarczającej dokładności, aby być stosowana na poziomie badań przesiewowych.

2. CELE BADANIA

Naszym celem jest:

1. Ocena dokładności bardziej innowacyjnych i łatwiej dostępnych biomarkerów we wczesnych stadiach pogorszenia funkcji poznawczych w przewidywaniu obecności biologicznie zdiagnozowanej AD na podstawie biomarkerów CSF.
2. Wyjaśnienie użyteczności technik, które były już badane w tym kontekście, ale dawały sprzeczne wyniki, takich jak wyniki neuropsychologiczne i elektroencefalografia (EEG).
3. Zbadanie nowych technik analizy, które nie zostały jeszcze zastosowane w tej dziedzinie, takich jak automatyczna analiza nagrań mowy (analiza mowy).
4. Ocena wkładu wariantów genetycznych w ryzyko AD u pacjentów z SCD.
5. Połączenie cech i danych wyekstrahowanych z tych technik przy użyciu podejścia uczenia maszynowego w celu opracowania modelu predykcyjnego AD u pacjentów z SCD.

3. PROJEKT BADANIA Jest to wieloośrodkowe, podłużne badanie o niskiej interwencji. Pacjenci będą rekrutowani z U.O.C. Neurologii w IRCCS Policlinico San Donato (dalej określanej jako UO1) oraz z Centrum Badań i Innowacji w Demencji (CRIDEM) w Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi we Florencji, Włochy (AOUC, dalej określanej jako UO2).

Wszyscy rekrutowani pacjenci przejdą:

1. dogłębny wywiad rodzinny i kliniczny;
2. szeroką ocenę neuropsychologiczną, w tym nagranie mowy, oszacowanie rezerwy poznawczej, ocenę depresji i cech osobowości;
3. zapis EEG w stanie spoczynku;
4. analizę następujących biomarkerów krwi: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL i GFAP;
5. analizę następujących genów: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analizę biomarkerów w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau i t-tau.

3.1. POPULACJA BADANA.

Zostaną rekrutowani pacjenci spełniający następujące kryteria:

1. Wiek ≥18 lat
2. Kliniczne rozpoznanie SCD według kryteriów SCD-I4;
3. Wynik Mini-Mental State Examination (MMSE) większy niż 24, skorygowany o wiek i poziom wykształcenia;
4. Normalna funkcjonalność w skalach Activities of Daily Living (ADL) i Instrumental Activities of Daily Living (IADL).

Pacjenci z:

a. Wywiadem urazu głowy; b. Trwającą chorobą neurologiczną i/lub ogólnoustrojową; c. Objawami psychozy, ciężkiej depresji lub zaburzenia używania substancji.

4. PROCEDURA BADANIA 4.1. OCENA NEUROPSYCHOLOGICZNA, OCENA DEPRESJI I OSZACOWANIE REZERWY POZNAWCZEJ Dogłębne badanie neuropsychologiczne będzie przeprowadzone na początku (rekrutacja) i podczas obserwacji (po dwóch latach) w IRCCS Policlinico San Donato (dla pacjentów z UO1) oraz w AOU Careggi (dla pacjentów z UO2) i będzie obejmować: globalne miary poznawcze (Mini Mental State Examination); zadania badające pamięć krótko- i długotrwałą werbalną i przestrzenną, uwagę, język, praksję konstruktywną i funkcje wykonawcze; subiektywne postrzeganie deficytów pamięci opisane przez Mazzeo i in.; wskaźniki rezerwy poznawczej, takie jak inteligencja przedchorobowa i aktywności rekreacyjne; objawy depresyjne; wskaźnik niezależności w czynnościach dnia codziennego; cechy osobowości.

4.2. NAGRYWANIE I WSTĘPNE PRZETWARZANIE MOWY Nagranie mowy odbędzie się podczas zadania opisywania obrazu w ramach Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). W cichym i kontrolowanym środowisku pacjenci zostaną poproszeni o opisanie "Summer Time Picture" zgodnie ze standardową procedurą. Nagranie głosu zostanie wykonane za pomocą dedykowanego systemu, z częstotliwością próbkowania 44 100 Hz, znormalizowane do osiągnięcia szczytu -1 dB i zredukowane do 48 kHz. Do ekstrakcji segmentów audio zostanie użyty algorytm Voice Activity Detection (VAD) webRTC.

4.3. NAGRYWANIE EEG, WSTĘPNE PRZETWARZANIE I EKSTRAKCJA CECH Dane EEG w stanie spoczynku będą zbierane w IRCCS Policlinico San Donato (dla pacjentów z UO1) oraz w AOU Careggi (Florencja, Włochy) (dla pacjentów z UO2). Zostanie użyty standardowy 21-kanałowy system. Nagrywanie EEG rozpocznie się od 10 minut z zamkniętymi oczami, a następnie na przemian 3 minuty z otwartymi oczami i 3 minuty z zamkniętymi oczami, powtórzone dwukrotnie. Do analizy zostaną użyte tylko segmenty z zamkniętymi oczami.

4.4. POBIERANIE, OBRÓBKA I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK BIOLOGICZNYCH Próbki krwi zostaną pobrane przez wenopunkcję do standardowych probówek polipropylenowych z EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy) w Oddziale Neurologii Polikliniki San Donato i w Oddziale Neurologii Szpitala Uniwersyteckiego Careggi. Zgodnie z rutynową praktyką kliniczną dla pacjentów z pogorszeniem funkcji poznawczych, po uzyskaniu świadomej zgody na nakłucie lędźwiowe, próbki CSF zostaną pobrane o godzinie 8 rano przez nakłucie lędźwiowe w Oddziale Neurologii Polikliniki San Donato i w Oddziale Neurologii Szpitala Uniwersyteckiego Careggi. Próbki zostaną natychmiast odwirowane i przechowywane w -80°C do czasu analizy. Próbki krwi zostaną pobrane w dwóch momentach: podczas pierwszych ocen klinicznych (pobranie wyjściowe) i dwa lata po pierwszym pobraniu (pobranie w trakcie obserwacji).

Próbki biologiczne od pacjentów z UO1 i powiązane dane zebrane do badania zostaną przekazane do biobanku BioCor w IRCCS Policlinico San Donato w celu przetworzenia i późniejszego przechowywania. Próbki będą przechowywane w biobanku BioCor do 25 lat.

Próbki biologiczne od pacjentów z UO2 i powiązane dane zebrane do badania zostaną przekazane do laboratorium neurogenetyki AOUC w celu przetworzenia i późniejszego przechowywania. Zostaną odwirowane w ciągu dwóch godzin przy 1300 rcf w 4°C przez 10 minut, a osocze zostanie wyizolowane i przechowywane w -80°C do czasu analizy.

4.5. ANALIZA BIOMARKERÓW KRWI Analiza biomarkerów osocza zostanie wykonana na próbkach pobranych na początku i w dwuletniej obserwacji w Laboratorium Neurogenetyki AOU Careggi przy użyciu zestawu Simoa dla próbek ludzkich dostarczonego przez Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) na zautomatyzowanej platformie Simoa SR-X (GBIO, Hangzhou, Chiny), zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenia biomarkerów osocza wszystkich próbek zostaną zmierzone w jednym przebiegu. Kontrolki jakości zostaną włączone do analizy i testowane razem z próbkami. Krzywa kalibracyjna zostanie określona przez pomiary seryjnie rozcieńczonego kalibratora dostarczonego przez Quanterix.

4.6. ANALIZA BIOMARKERÓW CSF Stężenia Aβ42, Aβ40, t-tau i p-tau zostaną zmierzone w Laboratorium Neurogenetyki AOUC przy użyciu analizatora chemiluminescencyjnego testu immunoenzymatycznego (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokio, Japonia). Wartości odcięcia dla CSF zostaną określone zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez Fujirebio.

4.7. ANALIZA GENETYCZNA Analizy genetyczne zostaną wykonane w Laboratorium Neurogenetyki AOUC.

Do izolacji DNA z próbek krwi zostanie użyta standardowa zautomatyzowana metoda (QIAcube, QIAGEN). Wybrane geny zostaną przeanalizowane w następujący sposób:

• APP, PSEN1, PSEN2: Wszystkie eksony kodujące i granice intron/ekson zostaną amplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu starterów zaprojektowanych za pomocą oprogramowania Primer3.
• Genotypy APOE: Genotypy APOE zostaną zbadane przez HRMA. Jako standardowe odniesienia zostaną użyte próbki o znanych genotypach APOE zwalidowanych przez sekwencjonowanie DNA.

• Ekspansje powtórzeń CAG w HTT: Zostaną określone za pomocą testu amplifikacji PCR, przy użyciu starterów znakowanych fluorescencyjnie. Rozmiar fragmentu zostanie określony przez elektroforezę kapilarną przy użyciu "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) i oprogramowania GeneMapper wersja 4.0 (Applied Biosystems). Jako standard wielkości zostanie użyty zestaw alleli CAG HTT, których długości zostaną potwierdzone przez sekwencjonowanie DNA.

  5. ANALIZA DANYCH

Analiza danych będzie składać się z następujących kroków:

1. Opisowa analiza statystyczna
2. Trenowanie i testowanie modelu uczenia maszynowego

5.1. OPISOWA ANALIZA STATYSTYCZNA Rozkład zmiennych zostanie oceniony za pomocą testu Shapiro-Wilka. Grupy pacjentów zostaną scharakteryzowane przy użyciu średniej i odchylenia standardowego, median i zakresów międzykwartylowych (IQR), częstości lub procentów oraz 95% przedziałów ufności odpowiednio dla zmiennych ciągłych, zmiennych ciągłych o nienormalnym rozkładzie i zmiennych kategorycznych. W zależności od rozkładu danych użyjemy testów ANOVA lub nieparametrycznych Kruskala-Wallisa dla porównań międzygrupowych oraz współczynnika korelacji Pearsona lub Spearmana do oceny korelacji między miarami liczbowymi. Testy chi-kwadrat zostaną użyte do porównania danych kategorycznych. Wielkości efektu zostaną obliczone przy użyciu d Cohena dla normalnie rozłożonych miar liczbowych, η² dla testu U Manna-Whitneya i testu V Cramera dla danych kategorycznych.

5.2. TRENOWANIE I TESTOWANIE MODELU UCZENIA MASZYNOWEGO Zdefiniujemy zestaw multimodalnych cech obejmujących wyniki neuropsychologiczne, wskaźniki rezerwy poznawczej, cechy osobowości, cechy EEG, biomarkery osocza i warianty genetyczne. Wspólna metryka zostanie zdefiniowana na podstawie dyspersji każdego wymiaru profilu, a następnie wytrenujemy algorytm uczenia maszynowego, aby powiązać każdy "wektor" profilu z profilami biomarkerów. Początkowo wykonamy tę klasyfikację przy użyciu standardowych procedur uczenia maszynowego. W oddzielnym zestawie analiz zastosujemy podejście głębokiego uczenia, trenując wielopoziomową sieć neuronową typu feedforward (ANN) do przewidywania profili biomarkerów CSF pacjentów. Model o najlepszej wydajności (ocenionej przez AUC krzywych ROC) zostanie przetestowany na zestawie testowym, aby uzyskać obiektywną ocenę wydajności modelu.

6. WIELKOŚĆ PRÓBY Zakładając wartość AUC próbki 0,8, metoda obliczania błędu standardowego zaproponowana przez Hanleya i McNeila (1982) pozwoli określić granice przedziału ufności, z 40 pacjentami w grupie z chorobą Alzheimera (20%) i 160 w grupie bez (80%, procenty szacowane na podstawie danych z wcześniejszych badań przeprowadzonych w AOU Careggi15), o szerokości 0,173 (0,713-0,887). Przy innych równych warunkach, zakładając AUC 0,9, przedział ufności wyniesie 0,131 (0,834-0,966). Uwzględniając 20% utratę pacjentów, próba osób do rekrutacji wynosi 250.