Alzheimerin taudin merkki subjektiivisessa kognitiivisessa heikkenemisessä (SIGN-AL)

1. JOHDANTO Alzheimerin taudin (AD) tutkimus ja kliininen käytäntö ovat käännekohdassa. Kun tautimuuntavia hoitoja (DMT) Alzheimerin taudille tulee saataville, neurologit, tutkijat ja terveyspalvelut kohtaavat ennustettavan, kasvavan kysynnän kognitiivisen heikentymän potilaiden diagnostiikka-arvioinneille. Lisäksi vallitsee yksimielisyys, että DMT:t tulisi antaa taudin varhaisimmissa vaiheissa pysäyttääkseen tautiprosessi ennen neurodegeneraation alkamista. Tästä syystä kansainvälinen tutkimus keskittyy subjektiiviseen kognitiiviseen heikkenemiseen (SCD) ja lievään kognitiiviseen häiriöön (MCI), joita pidetään AD:n varhaisimpina ilmenemismuotoina ja tulevien DMT:iden optimaalisena kohderyhmänä. Kuitenkin sekä MCI että SCD ovat erittäin yleisiä ja heterogeenisia tiloja, joilla on erilaisia mahdollisia kehityskulkuja ja monia mahdollisia taustasyitä. Taudin nykyiset tunnustetut biomarkkerit (aivojen MRI, PET-neurokuvantaminen ja selkäydinnesteen [CSF] biomarkkerit) ovat erittäin tarkkoja tunnistaessaan potilaita, joilla on Alzheimerin taudin aiheuttama SCD tai MCI, mutta niiden laajamittainen käyttö on erittäin rajoitettua korkean kustannuksen, huonon saatavuuden ja invasiivisuuden vuoksi.

   Tästä syystä aiemmat tutkimukset ovat esittäneet demografisten, kognitiivisten ja geneettisten ominaisuuksien huomioimista dementia-riskien arvioinnissa. Lisäksi veripohjaisia biomarkkereita pidetään lupaavina työkaluina, jotka mahdollistavat arvioinnin perusterveydenhuollon tasolla. Kuitenkaan yksikään näistä arvioinneista tai työkaluista yksinään ei voi taata riittävää tarkkuutta käytettäväksi seulontatasolla.

2. TUTKIMUKSEN TAVOITE

Tavoitteemme on:

1. Arvioida innovatiivisempien ja helpommin saatavilla olevien biomarkkerien tarkkuutta kognitiivisen heikkenemisen varhaisimmissa vaiheissa ennustettaessa biologisesti diagnosoitua AD:ta CSF-biomarkkereihin perustuen.
2. Selventää jo tässä yhteydessä tutkittujen, mutta ristiriitaisia tuloksia tuottaneiden tekniikoiden, kuten neuropsykologisten pisteytysten ja elektroenkefalografian (EEG), hyödyllisyyttä.
3. Tutkia uusia analyysitekniikoita, joita ei ole vielä sovellettu tälle alalle, kuten puheenauhoituksen automaattista analyysiä (puheanalyysi).
4. Arvioida geneettisten varianttien osuutta AD-riskissä potilailla, joilla on SCD.
5. Yhdistää näistä tekniikoista erotetut piirteet ja tiedot koneoppimismenetelmää hyödyntäen kehittääkseen ennustavan AD-mallin potilaille, joilla on SCD.

3. TUTKIMUSSUUNNITTELMA Tämä on monikeskuksinen, pitkittäinen, vähäisen intervention tutkimus. Potilaat rekrytoidaan U.O.C. of Neurology at IRCCS Policlinico San Donatosta (jäljempänä UO1) ja Center for Research and Innovation in Dementia (CRIDEM) at Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggistä Firenzessä, Italiassa (AOUC, jäljempänä UO2).

Kaikki rekrytoidut potilaat suorittavat:

1. syvällisen perhe- ja kliinisen historian keräämisen;
2. laajan neuropsykologisen arvioinnin, mukaan lukien kielenauhoitus, kognitiivisen varannon arviointi, masennuksen ja persoonallisuuspiirteiden arviointi;
3. EEG-äänityksen lepotilassa;
4. seuraavien veribiomarkkerien analyysin: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL ja GFAP;
5. seuraavien geeni-analyysien: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. biomarkkerianalyysin selkäydinnesteessä (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau ja t-tau.

3.1. TUTKIMUSPOPULAATIO.

Potilaat, jotka täyttävät seuraavat kriteerit, rekrytoidaan:

1. Ikä ≥18 vuotta
2. Kliininen SCD-diagnoosi SCD-I-kriteerien4 mukaisesti;
3. Mini-Mental State Examination (MMSE) -pistemäärä yli 24, ikään ja koulutustasoon sovitettuna;
4. Normaali toimintakyky Activities of Daily Living (ADL) ja Instrumental Activities of Daily Living (IADL) -asteikoilla.

Potilaat, joilla on:

a. Aiempi aivovamma; b. Meneillään oleva neurologinen ja/tai systeminen sairaus; c. Psykoosin, vakavan masennuksen tai päihdehäiriön oireita.

4. TUTKIMUSMENETELMÄ 4.1. NEUROPSYKOLOGINEN ARVIOINTI, MASENNUKSEN ARVIOINTI JA KOGNITIIVISEN VARANNON ARVIOINTI Syvällinen neuropsykologinen tutkimus suoritetaan lähtötilanteessa (rekrytointi) ja seurannassa (kahden vuoden jälkeen) IRCCS Policlinico San Donatossa (UO1:stä rekrytoiduille potilaille) ja AOU Careggissä (UO2:sta rekrytoiduille potilaille) ja sisältää: globaaleja kognitiivisia mittareita (Mini Mental State Examination); tehtäviä, jotka tutkivat verbaalista ja spatiaalista lyhyen ja pitkän aikavälin muistia, tarkkaavaisuutta, kieltä, konstruktiivista praksista ja eksekutiivista toimintaa; muistivajeen subjektiivinen havaitseminen kuten Mazzeo et al. kuvaili; kognitiivisen varannon indikaattorit kuten premoordiaalinen älykkyys ja vapaa-ajan aktiviteetit; masennusoireet; itsenäisyysindeksi päivittäisissä toimissa; persoonallisuuspiirteet.

4.2. KIELEN ÄÄNITYS JA ESIKÄSITTELY Kielen äänitys tapahtuu Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND) -kuvankuvailutehtävän aikana. Hiljaisessa ja kontrolloidussa ympäristössä potilaita pyydetään kuvaamaan "Summer Time Picture" -kuvaa standardoidun menettelyn mukaisesti. Äänitys tehdään omistetulla järjestelmällä, näytteenottotaajuudella 44 100 Hz, normalisoituna saavuttaakseen -1 dB huippuarvon ja vähennettynä 48 kHz:iin. Voice Activity Detection (VAD) webRTC -algoritmia käytetään äänisegmenttien erottamiseen.

4.3. EEG-ÄÄNITYS, ESIKÄSITTELY JA PIIRTEIDEN EROTTAMINEN Lepotilan EEG-data kerätään IRCCS Policlinico San Donatossa (UO1:stä rekrytoiduille potilaille) ja AOU Careggissä (Firenze, Italia) (UO2:sta rekrytoiduille potilaille). Käytetään standardia 21-kanavajärjestelmää. EEG-äänitys alkaa 10 minuutilla silmät suljettuina, jota seuraa vuorotellen 3 minuuttia silmät auki ja 3 minuuttia silmät kiinni, toistettuna kahdesti. Vain silmät kiinni -segmenttejä käytetään analyysiin.

4.4. BIOLOGISTEN NÄYTEIDEN KERÄÄMINEN, KÄSITTELY JA VARASTOINTI Verinäytteet kerätään venipunktiolla standardipolypropeeniputkiin EDTA:lla (Sarstedt, Nümbrecht, Saksa) San Donaton polikliinikan neurologian yksikössä ja Careggin yliopistollisen sairaalan neurologian yksikössä. Kliinisen rutiinin mukaisesti potilaille, joilla on kognitiivinen heikkeneminen, hankittuaan tietoon perustuvan suostumuksen rachisenteesiin, CSF-näytteet kerätään kello 8 aamulla lumbaalipunktiolla San Donaton polikliinikan neurologian yksikössä ja Careggin yliopistollisen sairaalan neurologian yksikössä. Näytteet sentrifugoidaan välittömästi ja varastoidaan -80°C:seen, kunnes analyysi suoritetaan. Verinäytteet kerätään kahdessa vaiheessa: ensimmäisten kliinisten arviointien yhteydessä (lähtötilanteen keräys) ja kahden vuoden kuluttua ensimmäisestä keräyksestä (seurantakeräys).

UO1:stä rekrytoitujen potilaiden biologiset näytteet ja tutkimukseen kerätyt liittyvät tiedot siirretään BioCor-biopankkiin IRCCS Policlinico San Donatossa käsittelyä ja myöhempää varastointia varten. Näytteet varastoidaan BioCor-biopankissa jopa 25 vuodeksi.

UO2:sta rekrytoitujen potilaiden biologiset näytteet ja tutkimukseen kerätyt liittyvät tiedot siirretään AOUC Neurogenetics -laboratorioon käsittelyä ja myöhempää varastointia varten. Ne sentrifugoidaan kahden tunnin kuluessa 1300 rcf:ssä 4°C:ssä 10 minuutin ajan, ja plasma eristetään ja varastoidaan -80°C:seen, kunnes analyysi suoritetaan.

4.5. VERIBIOMARKKERIEN ANALYYSI Plasma-biomarkkerien analyysi suoritetaan lähtötilanteessa ja kahden vuoden seurannassa otetuista näytteistä AOU Careggi Neurogenetics -laboratoriossa käyttäen Simoa-kittiä ihmisnäytteille, jonka tarjoaa Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) automatoidulla Simoa SR-X -alustalla (GBIO, Hangzhou, Kiina), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikkien näytteiden plasman biomarkkeripitoisuudet mitataan yhdessä ajossa. Laadunvalvontaa sisällytetään analyysiin ja testataan yhdessä näytteiden kanssa. Kalibrointikäyrä määritetään Quanterixin tarjoamien sarjalla laimennetuilla kalibraattorimittauksilla.

4.6. CSF-BIOMARKKERIEN ANALYYSI Aβ42:n, Aβ40:n, t-taun ja p-taun pitoisuudet mitataan AOUC Neurogenetics -laboratoriossa käyttäen kemiluminesenssia käyttävää entsyymi-immunoanalyysiä (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokio, Japani). CSF:n raja-arvot määritetään Fujirebion tarjoamien ohjeiden mukaisesti.

4.7. GENEETTINEN ANALYYSI Geneettiset analyysit suoritetaan AOUC Neurogenetics -laboratoriossa.

DNA eristetään verinäytteistä käyttäen standardoitua automatisoitua menetelmää (QIAcube, QIAGEN). Valitut geenit analysoidaan seuraavasti:

• APP, PSEN1, PSEN2: Kaikki koodaavat eksonit ja introni/eksoni -rajat vahvistetaan polymeraasiketjureaktio (PCR) -menetelmällä käyttäen Primer3-ohjelmistolla suunniteltuja alukkeita.
• APOE-genotyypit: APOE-genotyypit tutkitaan HRMA:lla. DNA-sekvensoinnilla validoituja näytteitä, joilla on tunnetut APOE-genotyypit, käytetään standardivertailuina.

• HTT:n CAG-toistojen laajentumat: Ne määritetään polymeraasiketjureaktio-vahvistusmenetelmällä käyttäen fluoresoivilla merkityillä alukkeilla. Fragmenttikoko määritetään kapillaarielektroforeesilla käyttäen "SeqStudio Genetic Analyzer" -laitetta (ThermoFisher) ja GeneMapper version 4.0 -ohjelmistoa (Applied Biosystems). Sarjaa HTT CAG-alleeleja, joiden pituudet vahvistetaan DNA-sekvensoinnilla, käytetään kokostandardina.

  5. DATANANALYYSI

Datanalyysi koostuu seuraavista vaiheista:

1. Kuvaileva tilastollinen analyysi
2. Koneoppimismallin koulutus ja testaus

5.1. KUVAILEVA TILASTOLLINEN ANALYYSI Muuttujien jakauma arvioidaan Shapiro-Wilk-testillä. Potilasryhmät karakterisoidaan käyttäen keskiarvoa ja keskihajontaa, mediaaneja ja kvartiilivälejä (IQR), frekvenssejä tai prosentteja sekä 95 % luottamusvälejä jatkuville muuttujille, normaalisti jakautumattomille jatkuville muuttujille ja luokitteluille muuttujille. Riippuen datan jakaumasta, käytämme ANOVA- tai ei-parametrisia Kruskal-Wallis-testejä ryhmien välisiin vertailuihin, ja Pearsonin tai Spearmanin korrelaatiokerrointa arvioidaksemme korrelaatioita numeeristen mittareiden välillä. Khiin neliö -testejä käytetään luokitteluaineiston vertailuun. Vaikutuskoot lasketaan käyttäen Cohenin d:ää normaalisti jakautuneille numeerisille mittareille, η² Mann-Whitneyn U-testille ja Cramerin V -testiä luokitteluaineistolle.

5.2. KONEOPPIMISMALLIN KOULUTUS JA TESTAUS Määrittelemme joukon multimodaalisia piirteitä, mukaan lukien neuropsykologiset pisteytykset, kognitiivisen varannon indikaattorit, persoonallisuuspiirteet, EEG-piirteet, plasma-biomarkkerit ja geneettiset variantit. Yhteinen metriikka määritellään kunkin profiilidimension hajonnan perusteella, ja sitten koulutamme koneoppimisalgoritmin yhdistämään kukin profiili "vektori" biomarkkeriprofiileihin. Aluksi suoritamme tämän luokittelun käyttäen standardikoneoppimismenettelyjä. Erillisessä analyysisarjassa seuraamme syväoppimislähestymistapaa kouluttamalla monitasoisen eteenpäin suuntautuvan keinotekoisen neuroverkon (ANN) ennustamaan potilaiden CSF-biomarkkeriprofiileja. Parhaiten suoriutuva malli (arvioitu ROC-käyrien AUC-arvojen perusteella) testataan testijoukolla saadakseen puolueettoman arvion mallin suorituskyvystä.

6. OTOSKOKO Olettaen otos-AUC-arvoksi 0,8, Hanley ja McNeilin (1982) ehdottama standardivirheen laskentamenetelmä mahdollistaa luottamusvälin rajojen määrittämisen, kun Alzheimerin taudin ryhmässä on 40 potilasta (20 %) ja ryhmässä ilman 160 potilasta (80 %, prosenttiosuudet arvioitu aiemmissa AOU Careggissä suoritetuista tutkimuksista15 ), joiden leveys on 0,173 (0,713-0,887). Kaikki muut asiat pysyessä samana, oletetaan AUC 0,9, luottamusväli on 0,131 (0,834-0,966). Ottaen huomioon 20 %:n luopumisprosentin, rekrytoitavien henkilöiden otoskooksi saadaan 250.