Charakteristický rukopis Alzheimerovy choroby u subjektivního kognitivního poklesu (SIGN-AL)

1. ÚVOD Výzkum a klinická praxe Alzheimerovy choroby (AD) jsou na rozcestí. Vzhledem k tomu, že se stávají dostupnými terapie modifikující průběh onemocnění (DMTs) pro AD, budou neurologové, výzkumníci a zdravotnické služby čelit předvídatelné, rostoucí poptávce po diagnostických vyšetřeních pacientů s kognitivní poruchou. Kromě toho panuje shoda, že DMTs by měly být podávány v nejranějších stádiích onemocnění, aby byl zastaven proces onemocnění před začátkem neurodegenerace. Z tohoto důvodu se mezinárodní výzkum zaměřuje na subjektivní kognitivní pokles (SCD) a mírnou kognitivní poruchu (MCI), které jsou považovány za nejranější projevy AD a optimální cílovou populaci pro budoucí DMTs. Nicméně, jak MCI, tak SCD jsou velmi časté a heterogenní stavy s různými možnými trajektoriemi a mnoha potenciálními základními příčinami. Současné uznávané biomarkery pro onemocnění (mozková MRI, PET neurozobrazování a biomarkery mozkomíšního moku [CSF]) jsou vysoce přesné při identifikaci pacientů se SCD a MCI způsobenými Alzheimerovou chorobou, ale jejich rozsáhlé použití je extrémně omezeno kvůli vysokým nákladům, špatné dostupnosti a invazivitě.

   Z tohoto důvodu předchozí studie navrhly zvážit demografické, kognitivní a genetické charakteristiky k odhadu rizika demence. Kromě toho jsou biomarkery založené na krvi považovány za slibné nástroje, které umožňují hodnocení na úrovni primární péče. Nicméně, žádné z těchto hodnocení nebo nástrojů samotných nemůže zaručit dostatečnou přesnost pro použití na úrovni screeningu.

2. CÍL STUDIE

Naším cílem je:

1. Vyhodnotit přesnost inovativnějších a snadněji dostupných biomarkerů v nejranějších stádiích kognitivního poklesu při predikci přítomnosti biologicky diagnostikované AD na základě CSF biomarkerů.
2. Objasnit užitečnost technik, které již byly v této souvislosti studovány, ale přinesly protichůdné výsledky, jako jsou neuropsychologické skóre a elektroencefalografie (EEG).
3. Prozkoumat nové analytické techniky dosud nepoužité v této oblasti, jako je automatizovaná analýza záznamu řeči (analýza řeči).
4. Vyhodnotit příspěvek genetických variant k riziku AD u pacientů se SCD.
5. Kombinovat rysy a data získaná z těchto technik pomocí přístupu strojového učení k vývoji prediktivního modelu AD u pacientů se SCD.

3. DESIGN STUDIE Jedná se o multicentrickou, longitudinální, nízkointervenční studii. Pacienti budou rekrutováni z U.O.C. neurologie v IRCCS Policlinico San Donato (dále označované jako UO1) a z Centra pro výzkum a inovace v demenci (CRIDEM) v Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi ve Florencii, Itálie (AOUC, dále označované jako UO2).

Všichni rekrutovaní pacienti podstoupí:

1. hluboký sběr rodinné a klinické anamnézy;
2. rozsáhlé neuropsychologické hodnocení, včetně záznamu řeči, odhadu kognitivní rezervy, posouzení deprese a osobnostních rysů;
3. záznam EEG v klidovém stavu;
4. analýzu následujících krevních biomarkerů: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL a GFAP;
5. analýzu následujících genů: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analýzu biomarkerů v mozkomíšním moku (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau a t-tau.

3.1. POPULACE STUDIE.

Budou rekrutováni pacienti splňující následující kritéria:

1. Věk ≥18 let
2. Klinická diagnóza SCD podle kritérií SCD-I4 ;
3. Skóre Mini-Mental State Examination (MMSE) větší než 24, upravené pro věk a úroveň vzdělání;
4. Normální funkčnost na škálách Aktivita denního života (ADL) a Instrumentální aktivity denního života (IADL).

Pacienti s:

a. Anamnézou poranění hlavy; b. Probíhajícím neurologickým a/nebo systémovým onemocněním; c. Příznaky psychózy, velké deprese nebo poruchy užívání návykových látek.

4. POSTUP STUDIE 4.1. NEUROPSYCHOLOGICKÉ HODNOCENÍ, POSOUZENÍ DEPRESE A ODHAD KOGNITIVNÍ REZERVY Hloubkové neuropsychologické vyšetření bude provedeno na začátku (zařazení) a při sledování (po dvou letech) v IRCCS Policlinico San Donato (pro pacienty zařazené z UO1) a v AOU Careggi (pro pacienty zařazené v UO2) a bude zahrnovat: globální kognitivní měření (Mini Mental State Examination); úkoly zkoumající verbální a prostorovou krátkodobou a dlouhodobou paměť, pozornost, jazyk, konstruktivní praxi a exekutivní funkci; subjektivní vnímání paměťových deficitů, jak je popsáno Mazzeem a kol.; ukazatele kognitivní rezervy, jako je premorbidní inteligence a rekreační aktivity; depresivní příznaky; index nezávislosti v aktivitách denního života; osobnostní rysy.

4.2. ZÁZNAM A PŘEDPROCESNÍ ŘEČI Záznam řeči proběhne během úkolu popisu obrázku Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). V tichém a kontrolovaném prostředí bude pacientům požádáno, aby popsali "Letní obrázek" podle standardizovaného postupu. Záznam hlasu bude proveden pomocí vyhrazeného systému, s vzorkovací frekvencí 44 100 Hz, normalizovaný na dosažení vrcholu -1 dB a snížený na 48 kHz. Pro extrakci zvukových segmentů bude použit algoritmus Voice Activity Detection (VAD) webRTC.

4.3. ZÁZNAM EEG, PŘEDPROCESNÍ A EXTRAKCE RYSŮ Data EEG v klidu budou sbírána v IRCCS Policlinico San Donato (pro pacienty zařazené z UO1) a v AOU Careggi (Florencie, Itálie) (pro pacienty zařazené v UO2). Bude použit standardní 21-kanálový systém. Záznam EEG začne 10 minutami se zavřenýma očima, následovaný střídáním 3 minut s otevřenýma očima a 3 minut se zavřenýma očima, opakovaným dvakrát. Pro analýzu budou použity pouze segmenty se zavřenýma očima.

4.4. ODBĚR, ZPRACOVÁNÍ A SKLADOVÁNÍ BIOLOGICKÝCH VZORKŮ Vzorky krve budou odebrány venepunkcí do standardních polypropylenových zkumavek s EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Německo) na neurologickém oddělení Polykliniky San Donato a neurologickém oddělení Univerzitní nemocnice Careggi. Podle klinické rutiny pro pacienty s kognitivním poklesem, po získání informovaného souhlasu pro rachicentézu, budou vzorky CSF odebrány v 8 hodin ráno lumbální punkcí na neurologickém oddělení Polykliniky San Donato a neurologickém oddělení Univerzitní nemocnice Careggi. Vzorky budou okamžitě centrifugovány a skladovány při -80°C až do provedení analýzy. Vzorky krve budou odebrány ve dvou časových bodech: v době prvních klinických hodnocení (základní odběr) a dva roky po prvním odběru (následný odběr).

Biologické vzorky od pacientů zařazených v UO1 a přidružená data shromážděná pro studii budou převedeny do biobanky BioCor v IRCCS Policlinico San Donato ke zpracování a následnému skladování. Vzorky budou skladovány v biobance BioCor až 25 let.

Biologické vzorky od pacientů zařazených v UO2 a přidružená data shromážděná pro studii budou převedeny do laboratoře neurogenetiky AOUC ke zpracování a následnému skladování. Budou centrifugovány do dvou hodin při 1300 rcf při 4°C po dobu 10 minut, plazma bude izolována a skladována při -80°C až do analýzy.

4.5. ANALÝZA KREVNÍCH BIOMARKERŮ Analýza plazmatických biomarkerů bude provedena na vzorcích odebraných na začátku a na vzorcích z dvouletého sledování v laboratoři neurogenetiky AOU Careggi pomocí sady Simoa pro lidské vzorky poskytnuté společností Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) na automatizované platformě Simoa SR-X (GBIO, Hangzhou, Čína), podle pokynů výrobce. Koncentrace plazmatických biomarkerů všech vzorků budou měřeny v jedné běhu. Kontrolní vzorky budou zahrnuty do analýzy a testovány spolu se vzorky. Kalibrační křivka bude stanovena pomocí sériově zředěných kalibračních měření poskytnutých společností Quanterix.

4.6. ANALÝZA CSF BIOMARKERŮ Koncentrace Aβ42, Aβ40, t-tau a p-tau budou měřeny v laboratoři neurogenetiky AOUC pomocí chemiluminiscenčního enzymového imunoanalyzátoru (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokio, Japonsko). Mezní hodnoty pro CSF budou stanoveny podle pokynů poskytnutých společností Fujirebio.

4.7. GENETICKÁ ANALÝZA Genetické analýzy budou provedeny v laboratoři neurogenetiky AOUC.

Pro izolaci DNA z krevních vzorků bude použita standardní automatizovaná metoda (QIAcube, QIAGEN). Vybrané geny budou analyzovány následovně:

• APP, PSEN1, PSEN2: Všechny kódující exony a hranice intron/exon budou amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) pomocí primerů navržených softwarem Primer3.
• APOE genotypy: APOE genotypy budou zkoumány pomocí HRMA. Jako standardní reference budou použity vzorky se známými APOE genotypy ověřenými sekvenací DNA.

• CAG repetice v HTT: Budou stanoveny pomocí amplifikačního testu polymerázové řetězové reakce, s použitím fluorescenčně značených primerů. Velikost fragmentu bude stanovena kapilární elektroforézou pomocí "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) a software GeneMapper verze 4.0 (Applied Biosystems). Jako velikostní standard bude použit soubor HTT CAG alel, jejichž délky budou potvrzeny sekvenací DNA.

  5. ANALÝZA DAT

Analýza dat bude sestávat z následujících kroků:

1. Deskriptivní statistická analýza
2. Trénování a testování modelu strojového učení

5.1. DESKRIPTIVNÍ STATISTICKÁ ANALÝZA Rozdělení proměnných bude vyhodnoceno pomocí Shapiro-Wilkova testu. Skupiny pacientů budou charakterizovány pomocí průměru a směrodatné odchylky, mediánů a interkvartilových rozmezí (IQR), frekvencí nebo procent a 95% intervalů spolehlivosti pro spojité proměnné, nespojité spojité proměnné a kategorické proměnné. V závislosti na rozdělení dat použijeme ANOVA nebo neparametrické Kruskal-Wallisovy testy pro mezi-skupinová srovnání a Pearsonův nebo Spearmanův korelační koeficient k posouzení korelací mezi numerickými měřeními. Pro srovnání kategorických dat budou použity chí-kvadrát testy. Velikosti efektů budou vypočteny pomocí Cohenova d pro normálně rozdělená numerická měření, η² pro Mann-Whitneyův U test a Cramerova V testu pro kategorická data.

5.2. TRÉNOVÁNÍ A TESTOVÁNÍ MODELU STROJOVÉHO UČENÍ Definujeme soubor multimodálních rysů zahrnujících neuropsychologická skóre, ukazatele kognitivní rezervy, osobnostní rysy, rysy EEG, plazmatické biomarkery a genetické varianty. Bude definována společná metrika na základě disperze každé dimenze profilu, a poté natrénujeme algoritmus strojového učení, aby asocioval každý "vektor" profilu s profilovými biomarkery. Zpočátku provedeme tuto klasifikaci pomocí standardních procedur strojového učení. V samostatné sadě analýz budeme následovat přístup hlubokého učení trénováním víceúrovňové dopředné umělé neuronové sítě (ANN) k predikci profilů CSF biomarkerů pacientů. Model s nejlepším výkonem (hodnocený podle AUC křivek ROC) bude testován na testovací sadě, aby bylo získáno nezkreslené odhadnutí výkonu modelu.

6. VELIKOST VZORKU Za předpokladu hodnoty AUC vzorku 0,8, metoda výpočtu standardní chyby navržená Hanleyem a McNeilem (1982) umožní určit limity intervalu spolehlivosti, s 40 pacienty ve skupině s Alzheimerovou chorobou (20%) a 160 ve skupině bez ní (80%, procenta odhadnuta z dat předchozích studií provedených v AOU Careggi15), šířky 0,173 (0,713-0,887). Za stejných podmínek, za předpokladu AUC 0,9, bude interval spolehlivosti 0,131 (0,834-0,966). Uvažujeme-li odchod 20%, vzorek subjektů k zařazení činí 250.