La Firma della Malattia di Alzheimer nel Declino Cognitivo Soggettivo (SIGN-AL)

1. INTRODUZIONE La ricerca e la pratica clinica sulla malattia di Alzheimer (AD) sono a un punto di svolta. Con la disponibilità di terapie modificanti la malattia (DMT) per l'AD, neurologi, ricercatori e servizi sanitari dovranno affrontare una prevedibile e crescente domanda di valutazioni diagnostiche per pazienti con deterioramento cognitivo. Inoltre, c'è consenso sul fatto che le DMT dovrebbero essere somministrate nelle fasi più precoci della malattia per arrestare il processo patologico prima che inizi la neurodegenerazione. Per questo motivo, la ricerca internazionale si sta concentrando sul declino cognitivo soggettivo (SCD) e sul deterioramento cognitivo lieve (MCI), considerati le prime manifestazioni dell'AD e la popolazione target ottimale per le future DMT. Tuttavia, sia MCI che SCD sono condizioni molto comuni ed eterogenee con diverse possibili traiettorie e molte potenziali cause sottostanti. Gli attuali biomarcatori riconosciuti per la malattia (risonanza magnetica cerebrale, neuroimaging PET e biomarcatori del liquido cerebrospinale [CSF]) sono altamente accurati nell'identificare pazienti con SCD e MCI dovuti alla malattia di Alzheimer, ma il loro utilizzo su larga scala è estremamente limitato a causa dell'alto costo, della scarsa accessibilità e dell'invasività.

   Per questo motivo, studi precedenti hanno suggerito di considerare caratteristiche demografiche, cognitive e genetiche per stimare il rischio di demenza. Inoltre, i biomarcatori basati sul sangue sono considerati strumenti promettenti per consentire la valutazione a livello dell'assistenza primaria. Tuttavia, nessuna di queste valutazioni o strumenti da sola può garantire un'accuratezza sufficiente per essere utilizzata a livello di screening.

2. OBIETTIVO DELLO STUDIO

Ci proponiamo di:

1. Valutare l'accuratezza di biomarcatori più innovativi e facilmente accessibili nelle fasi più precoci del declino cognitivo nel predire la presenza di AD diagnosticata biologicamente sulla base dei biomarcatori CSF.
2. Chiarire l'utilità di tecniche già studiate in questo contesto ma che hanno prodotto risultati contrastanti, come i punteggi neuropsicologici e l'elettroencefalografia (EEG).
3. Esplorare nuove tecniche di analisi non ancora applicate a questo campo, come l'analisi automatizzata delle registrazioni vocali (analisi del linguaggio).
4. Valutare il contributo delle varianti genetiche al rischio di AD nei pazienti con SCD.
5. Combinare le caratteristiche e i dati estratti da queste tecniche utilizzando un approccio di apprendimento automatico per sviluppare un modello predittivo di AD nei pazienti con SCD.

3. DISEGNO DELLO STUDIO Questo è uno studio multicentrico, longitudinale, a bassa intervento. I pazienti saranno reclutati dalla U.O.C. di Neurologia dell'IRCCS Policlinico San Donato (da qui in poi indicata come UO1) e dal Centro di Ricerca e Innovazione nella Demenza (CRIDEM) dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi di Firenze, Italia (AOUC, da qui in poi indicata come UO2).

Tutti i pazienti reclutati saranno sottoposti a:

1. raccolta approfondita dell'anamnesi familiare e clinica;
2. valutazione neuropsicologica estensiva, inclusa registrazione del linguaggio, stima della riserva cognitiva, valutazione della depressione e dei tratti di personalità;
3. registrazione EEG in stato di riposo;
4. analisi dei seguenti biomarcatori ematici: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL e GFAP;
5. analisi dei seguenti geni: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analisi dei biomarcatori nel liquido cerebrospinale (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau e t-tau.

3.1. POPOLAZIONE DELLO STUDIO.

Saranno reclutati pazienti che soddisfano i seguenti criteri:

1. Età ≥18 anni
2. Diagnosi clinica di SCD secondo i criteri SCD-I4;
3. Punteggio del Mini-Mental State Examination (MMSE) superiore a 24, aggiustato per età e livello di istruzione;
4. Funzionalità normale sulle scale delle Attività della Vita Quotidiana (ADL) e delle Attività Strumentali della Vita Quotidiana (IADL).

Pazienti con:

a. Storia di trauma cranico; b. Malattia neurologica e/o sistemica in corso; c. Sintomi di psicosi, depressione maggiore o disturbo da uso di sostanze.

4. PROCEDURA DELLO STUDIO 4.1. VALUTAZIONE NEUROPSICOLOGICA, VALUTAZIONE DELLA DEPRESSIONE E STIMA DELLA RISERVA COGNITIVA L'esame neuropsicologico approfondito sarà condotto al basale (arruolamento) e al follow-up (dopo due anni) presso l'IRCCS Policlinico San Donato (per pazienti arruolati da UO1) e presso l'AOU Careggi (per pazienti arruolati da UO2) e includerà: misure cognitive globali (Mini Mental State Examination); compiti che esplorano la memoria a breve e lungo termine verbale e spaziale, l'attenzione, il linguaggio, le prassie costruttive e la funzione esecutiva; percezione soggettiva dei deficit di memoria come descritto da Mazzeo et al.; indicatori di riserva cognitiva come l'intelligenza premorbosa e le attività ricreative; sintomi depressivi; indice di indipendenza nelle attività della vita quotidiana; tratti di personalità.

4.2. REGISTRAZIONE E PRE-PROCESSAMENTO DEL LINGUAGGIO La registrazione del linguaggio avverrà durante il compito di descrizione dell'immagine dello Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). In un ambiente silenzioso e controllato, ai pazienti verrà chiesto di descrivere l'"Immagine del Tempo Estivo" seguendo una procedura standardizzata. La registrazione vocale sarà effettuata con un sistema dedicato, con una frequenza di campionamento di 44.100 Hz, normalizzata per raggiungere un picco di -1 dB, e ridotta a 48 kHz. L'algoritmo Voice Activity Detection (VAD) webRTC sarà utilizzato per estrarre i segmenti audio.

4.3. REGISTRAZIONE EEG, PRE-PROCESSAMENTO ED ESTRAZIONE DELLE CARATTERISTICHE I dati EEG a riposo saranno raccolti presso l'IRCCS Policlinico San Donato (per pazienti arruolati da UO1) e presso l'AOU Careggi (Firenze, Italia) (per pazienti arruolati da UO2). Verrà utilizzato il sistema standard a 21 canali. La registrazione EEG inizierà con 10 minuti a occhi chiusi, seguiti da alternanza di 3 minuti a occhi aperti e 3 minuti a occhi chiusi, ripetuti due volte. Solo i segmenti a occhi chiusi saranno utilizzati per l'analisi.

4.4. RACCOLTA, GESTIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI I campioni di sangue saranno raccolti per venipuntura in provette standard in polipropilene con EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Germania) presso l'Unità di Neurologia del Policlinico San Donato e l'Unità di Neurologia dell'Ospedale Universitario di Careggi. Come da routine clinica per pazienti con declino cognitivo, dopo aver acquisito il consenso informato per la rachicentesi, i campioni di CSF saranno raccolti alle 8 del mattino mediante puntura lombare presso l'Unità di Neurologia del Policlinico San Donato e l'Unità di Neurologia dell'Ospedale Universitario di Careggi. I campioni saranno immediatamente centrifugati e conservati a -80°C fino all'esecuzione delle analisi. I campioni di sangue saranno raccolti in due momenti: al momento delle prime valutazioni cliniche (raccolta basale) e due anni dopo la prima raccolta (raccolta di follow-up).

I campioni biologici dei pazienti arruolati presso UO1 e i dati associati raccolti per lo studio saranno trasferiti alla Biobanca BioCor dell'IRCCS Policlinico San Donato per l'elaborazione e la successiva conservazione. I campioni saranno conservati presso la Biobanca BioCor per un massimo di 25 anni.

I campioni biologici dei pazienti arruolati presso UO2 e i dati associati raccolti per lo studio saranno trasferiti al laboratorio di Neurogenetica AOUC per l'elaborazione e la successiva conservazione. Saranno centrifugati entro due ore a 1300 rcf a 4°C per 10 minuti, e il plasma sarà isolato e conservato a -80°C fino all'analisi.

4.5. ANALISI DEI BIOMARCATORI EMATICI L'analisi dei biomarcatori plasmatici sarà eseguita sui campioni prelevati al basale e sui campioni del follow-up biennale presso il Laboratorio di Neurogenetica AOU Careggi utilizzando il kit Simoa per campioni umani fornito da Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) sulla piattaforma automatizzata Simoa SR-X (GBIO, Hangzhou, Cina), seguendo le istruzioni del produttore. Le concentrazioni dei biomarcatori plasmatici di tutti i campioni saranno misurate in una singola esecuzione. I controlli di qualità saranno inclusi nell'analisi e testati insieme ai campioni. Una curva di calibrazione sarà determinata da misurazioni di calibratori diluiti serialmente forniti da Quanterix.

4.6. ANALISI DEI BIOMARCATORI CSF Le concentrazioni di Aβ42, Aβ40, t-tau e p-tau saranno misurate presso il Laboratorio di Neurogenetica AOUC utilizzando un analizzatore immunoenzimatico chemiluminescente (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokyo, Giappone). I valori di cut-off per il CSF saranno determinati seguendo le linee guida fornite da Fujirebio.

4.7. ANALISI GENETICA Le analisi genetiche saranno eseguite presso il Laboratorio di Neurogenetica AOUC.

Un metodo automatizzato standard (QIAcube, QIAGEN) sarà utilizzato per isolare il DNA dai campioni di sangue. I geni selezionati saranno analizzati come segue:

• APP, PSEN1, PSEN2: Tutti gli esoni codificanti e i confini introne/esone saranno amplificati mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando primer progettati con il software Primer3.
• Genotipi APOE: I genotipi APOE saranno investigati mediante HRMA. Campioni con genotipi APOE noti convalidati attraverso sequenziamento del DNA saranno utilizzati come riferimenti standard.

• Espansioni delle ripetizioni CAG in HTT: Saranno determinate mediante saggio di amplificazione della reazione a catena della polimerasi, utilizzando primer marcati con fluorescenza. La dimensione dei frammenti sarà determinata mediante elettroforesi capillare utilizzando il "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) e il software GeneMapper versione 4.0 (Applied Biosystems). Un insieme di alleli CAG di HTT, le cui lunghezze saranno confermate dal sequenziamento del DNA, sarà utilizzato come standard di dimensione.

  5. ANALISI DEI DATI

L'analisi dei dati consisterà nei seguenti passaggi:

1. Analisi statistica descrittiva
2. Addestramento e test del modello di apprendimento automatico

5.1. ANALISI STATISTICA DESCRITTIVA La distribuzione delle variabili sarà valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. I gruppi di pazienti saranno caratterizzati utilizzando media e deviazione standard, mediane e intervalli interquartili (IQR), frequenze o percentuali e intervalli di confidenza al 95% per variabili continue, variabili continue non distribuite normalmente e variabili categoriche, rispettivamente. A seconda della distribuzione dei dati, utilizzeremo test ANOVA o non parametrici di Kruskal-Wallis per confronti tra gruppi, e il coefficiente di correlazione di Pearson o Spearman per valutare le correlazioni tra misure numeriche. Test del chi-quadro saranno utilizzati per confrontare dati categorici. Le dimensioni dell'effetto saranno calcolate utilizzando la d di Cohen per misure numeriche distribuite normalmente, η² per il test U di Mann-Whitney, e il test V di Cramer per dati categorici.

5.2. ADDESTRAMENTO E TEST DEL MODELLO DI APPRENDIMENTO AUTOMATICO Defineremo un insieme di caratteristiche multimodali inclusi punteggi neuropsicologici, indicatori di riserva cognitiva, tratti di personalità, caratteristiche EEG, biomarcatori plasmatici e varianti genetiche. Verrà definita una metrica comune basata sulla dispersione di ciascuna dimensione del profilo, e poi addestreremo un algoritmo di apprendimento automatico per associare ogni "vettore" di profilo ai profili dei biomarcatori. Inizialmente, eseguiremo questa classificazione utilizzando procedure standard di apprendimento automatico. In un insieme separato di analisi, seguiremo un approccio di deep learning addestrando una rete neurale artificiale (ANN) feedforward multi-livello per predire i profili dei biomarcatori CSF dei pazienti. Il modello con le migliori prestazioni (valutate dalle AUC delle curve ROC) sarà testato sul set di test per ottenere una stima imparziale delle prestazioni del modello.

6. DIMENSIONE DEL CAMPIONE Assumendo un valore AUC campionario di 0,8, il metodo di calcolo dell'errore standard proposto da Hanley e McNeil (1982) permetterà di determinare i limiti dell'intervallo di confidenza, con 40 pazienti nel gruppo con malattia di Alzheimer (20%) e 160 nel gruppo senza (80%, percentuali stimate da dati di studi precedenti condotti presso AOU Careggi15), di ampiezza 0,173 (0,713-0,887). A parità di condizioni, assumendo un AUC di 0,9, l'intervallo di confidenzo sarà di 0,131 (0,834-0,966). Considerando un drop-out del 20%, il campione di soggetti da arruolare risulta essere di 250.