Alzheimers sjukdoms signatur i subjektiv kognitiv nedsättning (SIGN-AL)

1. INTRODUKTION Forskning och klinisk praxis inom Alzheimers sjukdom (AD) befinner sig vid en vändpunkt. Eftersom sjukdomsmodifierande terapier (DMTs) för AD blir tillgängliga kommer neurologer, forskare och hälso- och sjukvård att möta en förutsägbar, ökande efterfrågan på diagnostiska utvärderingar för patienter med kognitiv nedsättning. Dessutom råder konsensus om att DMTs bör administreras i sjukdomens tidigaste stadier för att stoppa sjukdomsprocessen innan neurodegenerationen börjar. Av denna anledning fokuserar internationell forskning på subjektiv kognitiv nedsättning (SCD) och mild kognitiv nedsättning (MCI), som anses vara de tidigaste manifestationerna av AD och den optimala målgruppen för framtida DMTs. Emellertid är både MCI och SCD mycket vanliga och heterogena tillstånd med olika möjliga förlopp och många potentiella underliggande orsaker. Nuvarande erkända biomarkörer för sjukdomen (hjärn-MRI, PET-neuroavbildning och cerebrospinalvätske [CSF]-biomarkörer) är mycket precisa i att identifiera patienter med SCD och MCI på grund av Alzheimers sjukdom, men deras storskaliga användning är extremt begränsad på grund av höga kostnader, dålig tillgänglighet och invasivitet.

   Av denna anledning har tidigare studier föreslagit att beakta demografiska, kognitiva och genetiska egenskaper för att uppskatta risken för demens. Dessutom anses blodbaserade biomarkörer vara lovande verktyg för att möjliggöra bedömning på primärvårdsnivå. Emellertid kan ingen av dessa bedömningar eller verktyg ensam garantera tillräcklig noggrannhet för att användas på screeningsnivå.

2. STUDIENS SYFTE

Vi syftar till att:

1. Utvärdera noggrannheten hos mer innovativa och lättillgängliga biomarkörer i de tidigaste stadierna av kognitiv nedgång för att förutsäga närvaron av biologiskt diagnostiserad AD baserat på CSF-biomarkörer.
2. Klargöra användbarheten av tekniker som redan har studerats i detta sammanhang men som har gett motstridiga resultat, såsom neuropsykologiska poäng och elektroencefalografi (EEG).
3. Utforska nya analysmetoder som ännu inte har tillämpats på detta område, såsom automatiserad analys av talinspelning (talsanalys).
4. Utvärdera bidraget av genetiska varianter till AD-risk hos patienter med SCD.
5. Kombinera funktioner och data extraherade från dessa tekniker med hjälp av en maskininlärningsmetod för att utveckla en prediktiv modell av AD hos patienter med SCD.

3. STUDIEDESIGN Detta är en multicentrisk, longitudinell, låginterventionsstudie. Patienter kommer att rekryteras från U.O.C. för neurologi vid IRCCS Policlinico San Donato (härefter kallad UO1) och från Center för forskning och innovation inom demens (CRIDEM) vid Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi i Florens, Italien (AOUC, härefter kallad UO2).

Alla rekryterade patienter kommer att genomgå:

1. djupgående insamling av familje- och klinisk historia;
2. omfattande neuropsykologisk utvärdering, inklusive språkinspelning, uppskattning av kognitiv reserv, bedömning av depression och personlighetsdrag;
3. EEG-inspelning i viloläge;
4. analys av följande blodbiomarkörer: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL och GFAP;
5. analys av följande gener: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analys av biomarkörer i cerebrospinalvätska (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau och t-tau.

3.1. STUDIEPOPULATION.

Patienter som uppfyller följande kriterier kommer att rekryteras:

1. Ålder ≥18 år
2. Klinisk diagnos av SCD enligt SCD-I-kriterier4 ;
3. Mini-Mental State Examination (MMSE)-poäng större än 24, justerad för ålder och utbildningsnivå;
4. Normal funktionalitet på Activities of Daily Living (ADL) och Instrumental Activities of Daily Living (IADL) skalor.

Patienter med:

a. Tidigare huvudskada; b. Pågående neurologisk och/eller systemisk sjukdom; c. Symtom på psykos, större depression eller substansbrukssyndrom.

4. STUDIEPROCEDUR 4.1. NEUROPSYKOLOGISK UTVÄRDERING, BEDÖMNING AV DEPRESSION OCH UPPSKATTNING AV KOGNITIV RESERV Den djupgående neuropsykologiska undersökningen kommer att genomföras vid baslinje (rekrytering) och vid uppföljning (efter två år) vid IRCCS Policlinico San Donato (för patienter rekryterade från UO1) och vid AOU Careggi (för patienter rekryterade vid UO2) och kommer att inkludera: globala kognitiva mått (Mini Mental State Examination); uppgifter som utforskar verbal och rumslig kort- och långtidsminne, uppmärksamhet, språk, konstruktiv praxis och exekutiv funktion; subjektiv uppfattning av minnesbrister som beskrivs av Mazzeo et al.; indikatorer på kognitiv reserv som premorbid intelligens och fritidsaktiviteter; depressiva symtom; oberoendeindex i dagliga aktiviteter; personlighetsdrag.

4.2. INSPELNING OCH FÖRBEHANDLING AV SPRÅK Språkinspelning kommer att ske under Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND) bildbeskrivningsuppgift. I en tyst och kontrollerad miljö kommer patienter att ombes att beskriva "Summer Time Picture" enligt en standardiserad procedur. Röstinspelning kommer att göras med ett dedikerat system, med en samplingsfrekvens på 44 100 Hz, normaliserad för att nå en topp på -1 dB och reducerad till 48 kHz. Voice Activity Detection (VAD) webRTC-algoritmen kommer att användas för att extrahera audiosegment.

4.3. EEG-INSPELNING, FÖRBEHANDLING OCH FUNKTIONSEXTRAHERING EEG-data i viloläge kommer att samlas in vid IRCCS Policlinico San Donato (för patienter rekryterade från UO1) och vid AOU Careggi (Florens, Italien) (för patienter rekryterade vid UO2). Det standardiserade 21-kanalssystemet kommer att användas. EEG-inspelningen börjar med 10 minuter med slutna ögon, följt av alternerande 3 minuter med öppna ögon och 3 minuter med slutna ögon, upprepade två gånger. Endast segmenten med slutna ögon kommer att användas för analys.

4.4. INSAMLING, HANTERING OCH LAGRING AV BIOLOGISKA PROVER Blodprover kommer att samlas in genom venpunktur i standard polypropylenrör med EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) vid neurologiavdelningen på San Donato Polyklinik och neurologiavdelningen på Careggi universitetssjukhus. Enligt klinisk rutin för patienter med kognitiv nedgång, efter inhämtat informerat samtycke för rachicentesis, kommer CSF-prover att samlas in kl 8 på morgonen genom lumbalpunktion vid neurologiavdelningen på Policlinico San Donato och neurologiavdelningen på Careggi universitetssjukhus. Proverna kommer omedelbart centrifugeras och lagras vid -80°C tills analys utförs. Blodprover kommer att samlas in vid två tillfällen: vid tidpunkten för de första kliniska bedömningarna (baslinjeinsamling) och två år efter den första insamlingen (uppföljningsinsamling).

Biologiska prover från patienter rekryterade vid UO1 och tillhörande data insamlade för studien kommer att överföras till BioCor Biobank vid IRCCS Policlinico San Donato för bearbetning och efterföljande lagring. Proverna kommer att lagras på BioCor Biobank i upp till 25 år.

Biologiska prover från patienter rekryterade vid UO2 och tillhörande data insamlade för studien kommer att överföras till AOUC Neurogenetics laboratorium för bearbetning och efterföljande lagring. De kommer att centrifugeras inom två timmar vid 1300 rcf vid 4°C i 10 minuter, och plasmat kommer att isoleras och lagras vid -80°C tills analys.

4.5. ANALYS AV BLODBIOMARKÖRER Analys av plasmabiomarkörer kommer att utföras på proverna tagna vid baslinje och tvåårsuppföljningsproverna vid AOU Careggi Neurogenetics Laboratorium med hjälp av Simoa-kit för humana prover tillhandahållna av Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) på den automatiserade Simoa SR-X-plattformen (GBIO, Hangzhou, Kina), enligt tillverkarens instruktioner. Plasmabiomarkörkoncentrationer av alla prover kommer att mätas i en enda körning. Kvalitetskontroller kommer att inkluderas i analysen och testas tillsammans med proverna. En kalibreringskurva kommer att bestämmas genom serieutspädda kalibratorer tillhandahållna av Quanterix.

4.6. ANALYS AV CSF-BIOMARKÖRER Koncentrationer av Aβ42, Aβ40, t-tau och p-tau kommer att mätas vid AOUC Neurogenetics Laboratorium med hjälp av en kemiluminiscent enzymimmunoassayanalysator (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokyo, Japan). Cut-off-värden för CSF kommer att bestämmas enligt riktlinjerna från Fujirebio.

4.7. GENETISK ANALYS Genetiska analyser kommer att utföras vid AOUC Neurogenetics Laboratorium.

En standardiserad automatisk metod (QIAcube, QIAGEN) kommer att användas för att isolera DNA från blodprover. De utvalda generna kommer att analyseras enligt följande:

• APP, PSEN1, PSEN2: Alla kodande exoner och intron/exon-gränser kommer att amplifieras med polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av primer designade med Primer3-programvara.
• APOE-genotyper: APOE-genotyper kommer att undersökas med HRMA. Prover med kända APOE-genotyper validerade genom DNA-sekvensering kommer att användas som standardreferenser.

• CAG-repeat expansioner i HTT: De kommer att bestämmas med polymeraskedjereaktionsamplifieringsanalys, med hjälp av fluorescerande märkta primer. Fragmentstorlek kommer att bestämmas med kapillärelektrofores med "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) och GeneMapper version 4.0-programvara (Applied Biosystems). En uppsättning HTT CAG-alleler, vars längder kommer att bekräftas genom DNA-sekvensering, kommer att användas som storleksstandard.

  5. DATAANALYS

Dataanalys kommer att bestå av följande steg:

1. Beskrivande statistisk analys
2. Träning och testning av maskininlärningsmodellen

5.1. BESKRIVANDE STATISTISK ANALYS Fördelningen av variabler kommer att utvärderas med Shapiro-Wilk-testet. Patientgrupperna kommer att karakteriseras med hjälp av medelvärde och standardavvikelse, medianer och interkvartilintervall (IQR), frekvenser eller procentandelar och 95% konfidensintervall för kontinuerliga variabler, icke-normalfördelade kontinuerliga variabler respektive kategoriska variabler. Beroende på datans fördelning kommer vi att använda ANOVA eller icke-parametriska Kruskal-Wallis-tester för jämförelser mellan grupper, och Pearsons eller Spearmans korrelationskoefficient för att bedöma korrelationer mellan numeriska mått. Chi-två-tester kommer att användas för att jämföra kategoriska data. Effektstorlekar kommer att beräknas med Cohens d för normalfördelade numeriska mått, η² för Mann-Whitneys U-test och Cramers V-test för kategoriska data.

5.2. TRÄNING OCH TESTNING AV MASKININLÄRNINGSMODELLEN Vi kommer att definiera en uppsättning multimodala funktioner inklusive neuropsykologiska poäng, indikatorer på kognitiv reserv, personlighetsdrag, EEG-funktioner, plasmabiomarkörer och genetiska varianter. En gemensam metrik kommer att definieras baserat på dispersionen av varje profildimension, och sedan kommer vi att träna en maskininlärningsalgoritm för att associera varje profil "vektor" med biomarkörprofiler. Inledningsvis kommer vi att utföra denna klassificering med standardmaskininlärningsprocedurer. I en separat uppsättning analyser kommer vi att följa ett djupinlärningsförhållningssätt genom att träna ett flernivå-feedforward artificiellt neuronnätverk (ANN) för att förutsäga patienternas CSF-biomarkörprofiler. Modellen med bästa prestanda (som bedöms av AUC för ROC-kurvorna) kommer att testas på testuppsättningen för att få en opartisk uppskattning av modellens prestanda.

6. URVALSTORLEK Antagande ett urvals-AUC-värde på 0,8 kommer standardfelberäkningsmetoden föreslagen av Hanley och McNeil (1982) att tillåta bestämning av konfidensintervallets gränser, med 40 patienter i gruppen med Alzheimers sjukdom (20%) och 160 i gruppen utan (80%, procentandelar uppskattade från data från tidigare studier utförda vid AOU Careggi15 ), med en bredd på 0,173 (0,713-0,887). Allt annat lika, antagande ett AUC på 0,9, kommer konfidensintervallet att vara 0,131 (0,834-0,966). Med hänsyn till en drop-out på 20% blir urvalet av ämnen att rekrytera 250.