Alzheimers sygdoms signatur i subjektiv kognitiv nedsættelse (SIGN-AL)

1. INTRODUKTION Forskning i og klinisk praksis for Alzheimers sygdom (AD) er ved et vendepunkt. Da sygdomsmodificerende terapier (DMT'er) for AD bliver tilgængelige, vil neurologer, forskere og sundhedstjenester stå over for en forudsigelig, stigende efterspørgsel efter diagnostiske vurderinger for patienter med kognitiv svækkelse. Derudover er der enighed om, at DMT'er skal gives i de tidligste stadier af sygdommen for at standse sygdomsprocessen, før neurodegeneration begynder. Af denne grund fokuserer international forskning på subjektiv kognitiv svækkelse (SCD) og mild kognitiv svækkelse (MCI), som betragtes som de tidligste manifestationer af AD og den optimale målgruppe for fremtidige DMT'er. Imidlertid er både MCI og SCD meget almindelige og heterogene tilstande med forskellige mulige forløb og mange potentielle underliggende årsager. Nuværende anerkendte biomarkører for sygdommen (hjerne-MRI, PET-neurobilleddannelse og cerebrospinalvæske [CSF]-biomarkører) er meget præcise til at identificere patienter med SCD og MCI på grund af Alzheimers sygdom, men deres storskalaanvendelse er ekstremt begrænset på grund af høje omkostninger, dårlig tilgængelighed og invasivitet.

   Af denne grund har tidligere studier foreslået at overveje demografiske, kognitive og genetiske egenskaber for at estimere risikoen for demens. Derudover betragtes blodbaserede biomarkører som lovende værktøjer til at muliggøre vurdering på primærplejeniveau. Imidlertid kan ingen af disse vurderinger eller værktøjer alene garantere tilstrækkelig nøjagtighed til at blive brugt på screeningsniveauet.

2. STUDIETS FORMÅL

Vi har til formål at:

1. Vurdere nøjagtigheden af mere innovative og let tilgængelige biomarkører i de tidligste stadier af kognitiv svækkelse i forudsigelsen af tilstedeværelsen af biologisk diagnosticeret AD baseret på CSF-biomarkører.
2. Afklare nytten af teknikker, der allerede er undersøgt i denne sammenhæng, men har givet modstridende resultater, såsom neuropsykologiske scoringer og elektroencefalografi (EEG).
3. Udforske nye analyseteknikker, der endnu ikke er anvendt på dette område, såsom automatiseret analyse af taleprover (taleanalyse).
4. Vurdere bidraget fra genetiske varianter til AD-risiko hos patienter med SCD.
5. Kombinere funktionerne og dataene udvundet fra disse teknikker ved hjælp af en maskinlæringstilgang til at udvikle en prædiktiv model for AD hos patienter med SCD.

3. STUDIEDESIGN Dette er et multicenter, longitudinelt, lav-interventionsstudie. Patienter vil blive rekrutteret fra U.O.C. for Neurologi på IRCCS Policlinico San Donato (herefter omtalt som UO1) og fra Center for Forskning og Innovation i Demens (CRIDEM) på Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi i Firenze, Italien (AOUC, herefter omtalt som UO2).

Alle rekrutterede patienter vil gennemgå:

1. dybdegående indsamling af familie- og klinisk historie;
2. omfattende neuropsykologisk vurdering, inklusive sprogindspilning, estimering af kognitiv reserve, vurdering af depression og personlighedstræk;
3. EEG-indspilning i hviletilstand;
4. analyse af følgende blodbiomarkører: Aß42, Aß40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL og GFAP;
5. analyse af følgende gener: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analyse af biomarkører i cerebrospinalvæske (CSF): Aß42, Aß40, p-tau og t-tau.

3.1. STUDIEPOPULATION.

Patienter, der opfylder følgende kriterier, vil blive rekrutteret:

1. Alder ≥18 år
2. Klinisk diagnose af SCD i henhold til SCD-I-kriterierne4;
3. Mini-Mental State Examination (MMSE)-score større end 24, justeret for alder og uddannelsesniveau;
4. Normal funktionalitet på Activities of Daily Living (ADL) og Instrumental Activities of Daily Living (IADL) skalaerne.

Patienter med:

a. Tidligere hovedskade; b. Igangværende neurologisk og/eller systemisk sygdom; c. Symptomer på psykose, større depression eller stofbrugsforstyrrelse.

4. STUDIEFORLØB 4.1. NEUROPSYKOLOGISK VURDERING, VURDERING AF DEPRESSION OG ESTIMERING AF KOGNITIV RESERVE Den dybdegående neuropsykologiske undersøgelse vil blive udført ved baseline (indmeldelse) og ved opfølgning (efter to år) på IRCCS Policlinico San Donato (for patienter indmeldt fra UO1) og på AOU Careggi (for patienter indmeldt på UO2) og vil omfatte: globale kognitive mål (Mini Mental State Examination); opgaver, der udforsker verbal og rumlig kort- og langtidshukommelse, opmærksomhed, sprog, konstruktiv praksi og eksekutiv funktion; subjektiv opfattelse af hukommelsesmangler som beskrevet af Mazzeo et al.; indikatorer for kognitiv reserve såsom præmorbid intelligens og fritidsaktiviteter; depressive symptomer; uafhængighedsindeks i daglige aktiviteter; personlighedstræk.

4.2. INDSAMLING OG FORBEHANDLING AF SPROG Sprogindspilning vil forekomme under Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND) billedbeskrivelsesopgaven. I en stille og kontrolleret omgivelse vil patienter blive bedt om at beskrive "Summer Time Picture" efter en standardiseret procedure. Stemmeindspilning vil blive foretaget med et dedikeret system, med en samplingsfrekvens på 44.100 Hz, normaliseret for at nå en top på -1 dB og reduceret til 48 kHz. Voice Activity Detection (VAD) webRTC-algoritmen vil blive brugt til at udtrække lydsegmenter.

4.3. EEG-INDSAMLING, FORBEHANDLING OG FUNKTIONSINDUDRAGNING Hviletilstands-EEG-data vil blive indsamlet på IRCCS Policlinico San Donato (for patienter indmeldt fra UO1) og på AOU Careggi (Firenze, Italien) (for patienter indmeldt på UO2). Det standard 21-kanals system vil blive brugt. EEG-indspilning vil begynde med 10 minutter med lukkede øjne, efterfulgt af skiftevis 3 minutter med åbne øjne og 3 minutter med lukkede øjne, gentaget to gange. Kun de lukkede-øjne segmenter vil blive brugt til analyse.

4.4. INDSAMLING, HÅNDTERING OG OPLAG RING AF BIOLOGISKE PRØVER Blodprøver vil blive indsamlet ved venepunktur i standard polypropylenrør med EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) på Neurologisk Afdeling på San Donato Policlinico og Neurologisk Afdeling på Universitetshospitalet i Careggi. Som per klinisk rutine for patienter med kognitiv svækkelse, efter at have erhvervet informeret samtykke for rachicentese, vil CSF-prøver blive indsamlet kl. 8 om morgenen ved lumbalpunktur på Neurologisk Afdeling på Policlinico San Donato og Neurologisk Afdeling på Careggi Universitetshospital. Prøver vil straks blive centrifugeret og opbevaret ved -80°C indtil analyse udføres. Blodprøver vil blive indsamlet ved to tidspunkter: ved den første kliniske vurdering (baseline-indsamling) og to år efter den første indsamling (opfølgningsindsamling).

Biologiske prøver fra patienter indmeldt på UO1 og tilhørende data indsamlet til studiet vil blive overført til BioCor Biobank på IRCCS Policlinico San Donato til behandling og efterfølgende opbevaring. Prøver vil blive opbevaret i BioCor Biobanken i op til 25 år.

Biologiske prøver fra patienter indmeldt på UO2 og tilhørende data indsamlet til studiet vil blive overført til AOUC Neurogenetik laboratoriet til behandling og efterfølgende opbevaring. De vil blive centrifugeret inden for to timer ved 1300 rcf ved 4°C i 10 minutter, og plasmaet vil blive isoleret og opbevaret ved -80°C indtil analyse.

4.5. ANALYSE AF BLODBIOMARKØRER Analyse af plasmabiomarkører vil blive udført på prøverne taget ved baseline og to-årige opfølgningsprøver på AOU Careggi Neurogenetik Laboratoriet ved hjælp af Simoa-kittet til humane prøver leveret af Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) på den automatiserede Simoa SR-X platform (GBIO, Hangzhou, Kina), efter producentens instruktioner. Plasmabiomarkørkoncentrationer af alle prøver vil blive målt i en enkelt kørsel. Kvalitetskontroller vil blive inkluderet i analysen og testet sammen med prøverne. En kalibreringskurve vil blive bestemt ved serielt fortyndede kalibratormålinger leveret af Quanterix.

4.6. ANALYSE AF CSF-BIOMARKØRER Koncentrationer af Aß42, Aß40, t-tau og p-tau vil blive målt på AOUC Neurogenetik Laboratoriet ved hjælp af en kemiluminescerende enzymimmunoassay-analyzer (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokyo, Japan). Cut-off-værdier for CSF vil blive bestemt efter retningslinjerne leveret af Fujirebio.

4.7. GENETISK ANALYSE Genetiske analyser vil blive udført på AOUC Neurogenetik Laboratoriet.

En standard automatiseret metode (QIAcube, QIAGEN) vil blive brugt til at isolere DNA fra blodprøver. De udvalgte gener vil blive analyseret som følger:

• APP, PSEN1, PSEN2: Alle kodende eksoner og intron/ekson-grænser vil blive forstærket ved polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af primere designet med Primer3-software.
• APOE-genotyper: APOE-genotyper vil blive undersøgt ved HRMA. Prøver med kendte APOE-genotyper valideret gennem DNA-sekventering vil blive brugt som standardreferencer.

• CAG-gentagelsesudvidelser i HTT: De vil blive bestemt ved polymerasekædereaktionsforstærkningsassay, ved hjælp af fluorescerende mærkede primere. Fragmentstørrelse vil blive bestemt ved kapillærelektroforese ved hjælp af "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) og GeneMapper version 4.0 software (Applied Biosystems). Et sæt HTT CAG-alleler, hvis længder vil blive bekræftet ved DNA-sekventering, vil blive brugt som størrelsessstandard.

  5. DATAANALYSE

Dataanalyse vil bestå af følgende trin:

1. Beskrivende statistisk analyse
2. Træning og test af maskinlæringsmodellen

5.1. BESKRIVENDE STATISTISK ANALYSE Fordelingen af variable vil blive vurderet ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen. Patientgrupperne vil blive karakteriseret ved hjælp af gennemsnit og standardafvigelse, medianer og interkvartilområder (IQR'er), frekvenser eller procenter og 95% konfidensintervaller for kontinuerte variable, ikke-normalfordelte kontinuerte variable og kategoriske variable, henholdsvis. Afhængigt af fordelingen af data vil vi bruge ANOVA eller ikke-parametriske Kruskal-Wallis-tests til mellemgruppesammenligninger og Pearson's eller Spearman's korrelationskoefficient til at vurdere korrelationer mellem numeriske mål. Chi-i-anden-tests vil blive brugt til at sammenligne kategoriske data. Effektstørrelser vil blive beregnet ved hjælp af Cohen's d for normalfordelte numeriske mål, η² for Mann-Whitney's U-test og Cramer's V-test for kategoriske data.

5.2. TRÆNING OG TEST AF MASKINLÆRINGSMODELLEN Vi vil definere et sæt af multimodale funktioner inklusive neuropsykologiske scoringer, indikatorer for kognitiv reserve, personlighedstræk, EEG-funktioner, plasmabiomarkører og genetiske varianter. En fælles metrik vil blive defineret baseret på spredningen af hver profildimension, og derefter vil vi træne en maskinlæringsalgoritme til at associere hver profil "vektor" med biomarkørprofiler. Oprindeligt vil vi udføre denne klassifikation ved hjælp af standard maskinlæringsprocedurer. I et separat sæt af analyser vil vi følge en deep learning-tilgang ved at træne et flerniveau feedforward kunstigt neuralt netværk (ANN) til at forudsige patienternes CSF-biomarkørprofiler. Modellen med den bedste præstation (som vurderet ved AUC'erne af ROC-kurverne) vil blive testet på testsettet for at opnå et upartisk estimat af modelpræstationen.

6. STIKPRØVESTØRRELSE Forudsat en stikprøve-AUC-værdi på 0,8, vil standardfejlberegningsmetoden foreslået af Hanley og McNeil (1982) gøre det muligt at bestemme konfidensintervallets grænser, med 40 patienter i gruppen med Alzheimers sygdom (20%) og 160 i gruppen uden (80%, procenter estimeret fra data fra tidligere studier udført på AOU Careggi15), af bredde 0,173 (0,713-0,887). Alt andet lige, forudsat en AUC på 0,9, vil konfidensintervallet være 0,131 (0,834-0,966). I betragtning af et drop-out på 20%, resulterer stikprøven af personer, der skal indmeldes, i 250.