Признаки болезни Альцгеймера при субъективном когнитивном снижении (SIGN-AL)

1. ВВЕДЕНИЕ Исследования и клиническая практика в области болезни Альцгеймера (БА) находятся на переломном этапе. По мере того, как становятся доступны модифицирующие течение болезни терапии (МТБ) для БА, неврологи, исследователи и службы здравоохранения столкнутся с предсказуемым, растущим спросом на диагностические обследования пациентов с когнитивными нарушениями. Кроме того, существует консенсус, что МТБ следует применять на самых ранних стадиях заболевания, чтобы остановить болезненный процесс до начала нейродегенерации. По этой причине международные исследования сосредоточены на субъективном когнитивном снижении (СКС) и легких когнитивных нарушениях (ЛКН), которые считаются самыми ранними проявлениями БА и оптимальной целевой популяцией для будущих МТБ. Однако как ЛКН, так и СКС являются очень распространенными и гетерогенными состояниями с различными возможными траекториями и множеством потенциальных основных причин. Современные признанные биомаркеры заболевания (МРТ головного мозга, ПЭТ-нейровизуализация и биомаркеры спинномозговой жидкости [СМЖ]) обладают высокой точностью в выявлении пациентов с СКС и ЛКН вследствие болезни Альцгеймера, но их широкомасштабное использование крайне ограничено из-за высокой стоимости, плохой доступности и инвазивности.

   По этой причине предыдущие исследования предлагали учитывать демографические, когнитивные и генетические характеристики для оценки риска деменции. Кроме того, биомаркеры на основе крови считаются перспективными инструментами, позволяющими проводить оценку на уровне первичной медико-санитарной помощи. Однако ни одна из этих оценок или инструментов по отдельности не может гарантировать достаточной точности для использования на скрининговом уровне.

2. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы стремимся:

1. Оценить точность более инновационных и легкодоступных биомаркеров на самых ранних стадиях когнитивного снижения в прогнозировании наличия биологически диагностированной БА на основе биомаркеров СМЖ.
2. Прояснить полезность методик, уже изученных в этом контексте, но давших противоречивые результаты, таких как нейропсихологические шкалы и электроэнцефалография (ЭЭГ).
3. Исследовать новые методы анализа, еще не применявшиеся в этой области, такие как автоматизированный анализ записи речи (речевой анализ).
4. Оценить вклад генетических вариантов в риск БА у пациентов с СКС.
5. Объединить признаки и данные, извлеченные из этих методик, с использованием подхода машинного обучения для разработки прогностической модели БА у пациентов с СКС.

3. ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ Это многоцентровое, лонгитюдное, исследование с низким уровнем вмешательства. Пациенты будут набираться из U.O.C. неврологии IRCCS Поликлиники Сан-Донато (в дальнейшем именуемой UO1) и из Центра исследований и инноваций в области деменции (CRIDEM) в университетской больнице Карреджи во Флоренции, Италия (AOUC, в дальнейшем именуемой UO2).

Все набранные пациенты пройдут:

1. углубленный сбор семейного и клинического анамнеза;
2. обширную нейропсихологическую оценку, включая запись речи, оценку когнитивного резерва, оценку депрессии и личностных черт;
3. запись ЭЭГ в состоянии покоя;
4. анализ следующих биомаркеров крови: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL и GFAP;
5. анализ следующих генов: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. анализ биомаркеров в спинномозговой жидкости (СМЖ): Aβ42, Aβ40, p-tau и t-tau.

3.1. ИССЛЕДУЕМАЯ ПОПУЛЯЦИЯ.

Будут набраны пациенты, соответствующие следующим критериям:

1. Возраст ≥18 лет
2. Клинический диагноз СКС согласно критериям SCD-I4 ;
3. Балл по Краткой шкале оценки психического статуса (MMSE) более 24, скорректированный с учетом возраста и уровня образования;
4. Нормальное функционирование по шкалам Повседневной активности (ADL) и Инструментальной повседневной активности (IADL).

Пациенты с:

а. Анамнезом черепно-мозговой травмы; б. Текущим неврологическим и/или системным заболеванием; в. Симптомами психоза, большой депрессии или расстройства, связанного с употреблением психоактивных веществ.

4. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. НЕЙРОПСИХОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА, ОЦЕНКА ДЕПРЕССИИ И ОЦЕНКА КОГНИТИВНОГО РЕЗЕРВА Углубленное нейропсихологическое обследование будет проводиться на исходном уровне (при включении) и при наблюдении (через два года) в IRCCS Поликлинике Сан-Донато (для пациентов, включенных из UO1) и в AOU Карреджи (для пациентов, включенных в UO2) и будет включать: общие когнитивные показатели (Краткая шкала оценки психического статуса); задачи, исследующие вербальную и пространственную кратковременную и долговременную память, внимание, речь, конструктивный праксис и исполнительную функцию; субъективное восприятие дефицита памяти, как описано Mazzeo et al.; показатели когнитивного резерва, такие как преморбидный интеллект и рекреационная активность; симптомы депрессии; индекс независимости в повседневной деятельности; личностные черты.

4.2. ЗАПИСЬ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА РЕЧИ Запись речи будет происходить во время задачи описания картинки в рамках Скрининга афазии при нейродегенерации (SAND). В тихой и контролируемой обстановке пациентам будет предложено описать «Летнюю картинку», следуя стандартизированной процедуре. Запись голоса будет производиться с помощью специальной системы, с частотой дискретизации 44 100 Гц, нормализованной для достижения пика -1 дБ и сниженной до 48 кГц. Для извлечения аудиосегментов будет использоваться алгоритм веб-RTC для обнаружения речевой активности (VAD).

4.3. ЗАПИСЬ ЭЭГ, ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА И ИЗВЛЕЧЕНИЕ ПРИЗНАКОВ Данные ЭЭГ покоя будут собираться в IRCCS Поликлинике Сан-Донато (для пациентов, включенных из UO1) и в AOU Карреджи (Флоренция, Италия) (для пациентов, включенных в UO2). Будет использована стандартная 21-канальная система. Запись ЭЭГ начнется с 10 минут с закрытыми глазами, затем последуют чередующиеся 3 минуты с открытыми глазами и 3 минуты с закрытыми глазами, повторенные дважды. Только сегменты с закрытыми глазами будут использоваться для анализа.

4.4. СБОР, ОБРАБОТКА И ХРАНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ Образцы крови будут собираться путем венепункции в стандартные полипропиленовые пробирки с ЭДТА (Sarstedt, Нюмбрехт, Германия) в неврологическом отделении поликлиники Сан-Донато и неврологическом отделении университетской больницы Карреджи. Как и в клинической практике для пациентов с когнитивным снижением, после получения информированного согласия на спинномозговую пункцию, образцы СМЖ будут собираться в 8 утра путем люмбальной пункции в неврологическом отделении поликлиники Сан-Донато и неврологическом отделении университетской больницы Карреджи. Образцы будут немедленно центрифугированы и храниться при -80°C до проведения анализа. Образцы крови будут собираться в два момента времени: во время первых клинических оценок (сбор на исходном уровне) и через два года после первого сбора (сбор при наблюдении).

Биологические образцы от пациентов, включенных в UO1, и связанные с ними данные, собранные для исследования, будут переданы в биобанк BioCor в IRCCS Поликлинике Сан-Донато для обработки и последующего хранения. Образцы будут храниться в биобанке BioCor до 25 лет.

Биологические образцы от пациентов, включенных в UO2, и связанные с ними данные, собранные для исследования, будут переданы в лабораторию нейрогенетики AOUC для обработки и последующего хранения. Они будут центрифугированы в течение двух часов при 1300 g при 4°C в течение 10 минут, плазма будет выделена и храниться при -80°C до анализа.

4.5. АНАЛИЗ БИОМАРКЕРОВ КРОВИ Анализ биомаркеров плазмы будет проводиться на образцах, взятых на исходном уровне, и образцах двухлетнего наблюдения в лаборатории нейрогенетики AOU Карреджи с использованием набора Simoa для человеческих образцов, предоставленного Quanterix Corporation (Лексингтон, Массачусетс, США), на автоматизированной платформе Simoa SR-X (GBIO, Ханчжоу, Китай), следуя инструкциям производителя. Концентрации биомаркеров плазмы всех образцов будут измерены за один прогон. Контроли качества будут включены в анализ и протестированы вместе с образцами. Калибровочная кривая будет определена с помощью серийно разбавленных измерений калибратора, предоставленных Quanterix.

4.6. АНАЛИЗ БИОМАРКЕРОВ СМЖ Концентрации Aβ42, Aβ40, t-tau и p-tau будут измеряться в лаборатории нейрогенетики AOUC с использованием хемилюминесцентного иммуноферментного анализатора (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Токио, Япония). Пороговые значения для СМЖ будут определены в соответствии с рекомендациями, предоставленными Fujirebio.

4.7. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Генетические анализы будут проводиться в лаборатории нейрогенетики AOUC.

Стандартный автоматизированный метод (QIAcube, QIAGEN) будет использоваться для выделения ДНК из образцов крови. Выбранные гены будут проанализированы следующим образом:

• APP, PSEN1, PSEN2: Все кодирующие экзоны и границы интрон/экзон будут амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, разработанных с помощью программного обеспечения Primer3.
• Генотипы APOE: Генотипы APOE будут исследованы с помощью HRMA. В качестве стандартных референсов будут использоваться образцы с известными генотипами APOE, валидированными с помощью секвенирования ДНК.

• Экспансии CAG-повторов в HTT: Они будут определены с помощью анализа амплификации полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно меченых праймеров. Размер фрагментов будет определен с помощью капиллярного электрофореза с использованием «SeqStudio Genetic Analyzer» (ThermoFisher) и программного обеспечения GeneMapper версии 4.0 (Applied Biosystems). В качестве стандарта размера будет использоваться набор аллелей CAG HTT, длина которых будет подтверждена секвенированием ДНК.

  5. АНАЛИЗ ДАННЫХ

Анализ данных будет состоять из следующих шагов:

1. Описательный статистический анализ
2. Обучение и тестирование модели машинного обучения

5.1. ОПИСАТЕЛЬНЫЙ СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Распределение переменных будет оценено с помощью теста Шапиро-Уилка. Группы пациентов будут охарактеризованы с использованием среднего значения и стандартного отклонения, медиан и межквартильных размахов (IQR), частот или процентов и 95% доверительных интервалов для непрерывных переменных, непрерывных переменных с ненормальным распределением и категориальных переменных соответственно. В зависимости от распределения данных мы будем использовать дисперсионный анализ ANOVA или непараметрические тесты Крускала-Уоллиса для сравнений между группами, а коэффициент корреляции Пирсона или Спирмена для оценки корреляций между числовыми показателями. Для сравнения категориальных данных будут использоваться критерии хи-квадрат. Размеры эффекта будут рассчитаны с использованием d Коэна для нормально распределенных числовых показателей, η² для U-критерия Манна-Уитни и критерия Крамера V для категориальных данных.

5.2. ОБУЧЕНИЕ И ТЕСТИРОВАНИЕ МОДЕЛИ МАШИННОГО ОБУЧЕНИЯ Мы определим набор мультимодальных признаков, включая нейропсихологические баллы, показатели когнитивного резерва, личностные черты, признаки ЭЭГ, биомаркеры плазмы и генетические варианты. Будет определена общая метрика на основе дисперсии каждого измерения профиля, а затем мы обучим алгоритм машинного обучения связывать каждый «вектор» профиля с профилями биомаркеров. Изначально мы выполним эту классификацию с использованием стандартных процедур машинного обучения. В отдельном наборе анализов мы будем следовать подходу глубокого обучения, обучая многоуровневую прямую искусственную нейронную сеть (ИНС) для прогнозирования профилей биомаркеров СМЖ у пациентов. Модель с наилучшей производительностью (оцененной по AUC кривых ROC) будет протестирована на тестовом наборе для получения несмещенной оценки производительности модели.

6. РАЗМЕР ВЫБОРКИ Предполагая выборочное значение AUC, равное 0,8, метод расчета стандартной ошибки, предложенный Хэнли и МакНилом (1982), позволит определить пределы доверительного интервала при 40 пациентах в группе с болезнью Альцгеймера (20%) и 160 в группе без нее (80%, проценты оценены на основе данных предыдущих исследований, проведенных в AOU Карреджи15), шириной 0,173 (0,713-0,887). При прочих равных условиях, предполагая AUC 0,9, доверительный интервал составит 0,131 (0,834-0,966). Учитывая отсев 20%, выборка субъектов для включения составляет 250.