Die Signatur der Alzheimer-Krankheit bei subjektivem kognitivem Abbau (SIGN-AL)

1. EINLEITUNG Die Alzheimer-Krankheit (AD)-Forschung und klinische Praxis befinden sich an einem Wendepunkt. Da krankheitsmodifizierende Therapien (DMTs) für AD verfügbar werden, stehen Neurologen, Forscher und Gesundheitsdienste vor einer vorhersehbaren, steigenden Nachfrage nach diagnostischen Untersuchungen für Patienten mit kognitiven Beeinträchtigungen. Darüber hinaus besteht Konsens darüber, dass DMTs in den frühesten Krankheitsstadien verabreicht werden sollten, um den Krankheitsprozess zu stoppen, bevor die Neurodegeneration einsetzt. Aus diesem Grund konzentriert sich die internationale Forschung auf subjektive kognitive Beeinträchtigung (SCD) und leichte kognitive Beeinträchtigung (MCI), die als die frühesten Manifestationen von AD und die optimale Zielpopulation für zukünftige DMTs angesehen werden. Allerdings sind sowohl MCI als auch SCD sehr häufige und heterogene Zustände mit unterschiedlichen möglichen Verläufen und vielen potenziellen zugrunde liegenden Ursachen. Aktuell anerkannte Biomarker für die Krankheit (Hirn-MRT, PET-Neurobildgebung und Liquor [CSF]-Biomarker) sind hochpräzise bei der Identifizierung von Patienten mit SCD und MCI aufgrund der Alzheimer-Krankheit, aber ihr großflächiger Einsatz ist aufgrund hoher Kosten, schlechter Zugänglichkeit und Invasivität extrem begrenzt.

   Aus diesem Grund haben frühere Studien vorgeschlagen, demografische, kognitive und genetische Merkmale zur Schätzung des Demenzrisikos zu berücksichtigen. Darüber hinaus werden blutbasierte Biomarker als vielversprechende Instrumente angesehen, um eine Bewertung auf der Ebene der Primärversorgung zu ermöglichen. Allerdings kann keine dieser Bewertungen oder Instrumente allein eine ausreichende Genauigkeit garantieren, um auf Screening-Ebene eingesetzt zu werden.

2. ZIEL DER STUDIE

Wir streben an:

1. Die Genauigkeit innovativerer und leichter zugänglicher Biomarker in den frühesten Stadien des kognitiven Abbaus bei der Vorhersage des Vorhandenseins biologisch diagnostizierter AD basierend auf CSF-Biomarkern zu bewerten.
2. Die Nützlichkeit von Techniken zu klären, die in diesem Zusammenhang bereits untersucht, aber widersprüchliche Ergebnisse geliefert haben, wie neuropsychologische Scores und Elektroenzephalographie (EEG).
3. Neue Analysetechniken zu erkunden, die noch nicht in diesem Bereich angewendet wurden, wie die automatisierte Analyse von Sprachaufnahmen (Sprachanalyse).
4. Den Beitrag genetischer Varianten zum AD-Risiko bei Patienten mit SCD zu bewerten.
5. Die Merkmale und Daten, die aus diesen Techniken extrahiert wurden, mithilfe eines maschinellen Lernansatzes zu kombinieren, um ein Vorhersagemodell für AD bei Patienten mit SCD zu entwickeln.

3. STUDIENDESIGN Dies ist eine multizentrische, longitudinale, niedrig-interventionelle Studie. Patienten werden aus der U.O.C. für Neurologie am IRCCS Policlinico San Donato (im Folgenden als UO1 bezeichnet) und aus dem Zentrum für Forschung und Innovation in Demenz (CRIDEM) an der Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi in Florenz, Italien (AOUC, im Folgenden als UO2 bezeichnet), rekrutiert.

Alle rekrutierten Patienten werden durchlaufen:

1. Vertiefte Erhebung der Familien- und Krankengeschichte;
2. Umfangreiche neuropsychologische Bewertung, einschließlich Sprachaufnahme, Schätzung der kognitiven Reserve, Bewertung von Depression und Persönlichkeitsmerkmalen;
3. EEG-Aufnahme im Ruhezustand;
4. Analyse der folgenden Blutbiomarker: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL und GFAP;
5. Analyse der folgenden Gene: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. Analyse von Biomarkern im Liquor (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau und t-tau.

3.1. STUDIENPOPULATION.

Patienten, die die folgenden Kriterien erfüllen, werden rekrutiert:

1. Alter ≥18 Jahre
2. Klinische Diagnose von SCD gemäß SCD-I-Kriterien4;
3. Mini-Mental State Examination (MMSE)-Score größer als 24, angepasst an Alter und Bildungsniveau;
4. Normale Funktionalität auf den Skalen für Aktivitäten des täglichen Lebens (ADL) und instrumentelle Aktivitäten des täglichen Lebens (IADL).

Patienten mit:

a. Vorgeschichte von Kopfverletzungen; b. Laufender neurologischer und/oder systemischer Erkrankung; c. Symptomen von Psychose, Major Depression oder Substanzgebrauchsstörung.

4. STUDIENPROZEDUR 4.1. NEUROPSYCHOLOGISCHE BEWERTUNG, BEWERTUNG VON DEPRESSION UND SCHÄTZUNG DER KOGNITIVEN RESERVE Die vertiefte neuropsychologische Untersuchung wird zu Studienbeginn (Einschluss) und bei der Nachuntersuchung (nach zwei Jahren) am IRCCS Policlinico San Donato (für Patienten aus UO1) und an der AOU Careggi (für Patienten aus UO2) durchgeführt und umfasst: globale kognitive Maße (Mini Mental State Examination); Aufgaben zur Untersuchung des verbalen und räumlichen Kurz- und Langzeitgedächtnisses, der Aufmerksamkeit, Sprache, konstruktiven Praxie und exekutiven Funktion; subjektive Wahrnehmung von Gedächtnisdefiziten wie von Mazzeo et al. beschrieben; Indikatoren der kognitiven Reserve wie prämorbide Intelligenz und Freizeitaktivitäten; depressive Symptome; Unabhängigkeitsindex bei Aktivitäten des täglichen Lebens; Persönlichkeitsmerkmale.

4.2. AUFNAHME UND VORVERARBEITUNG VON SPRACHE Die Sprachaufnahme erfolgt während der Aufgabe zur Bildbeschreibung im Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND). In einer ruhigen und kontrollierten Umgebung werden die Patienten gebeten, das "Summer Time Picture" gemäß einem standardisierten Verfahren zu beschreiben. Die Sprachaufnahme erfolgt mit einem dedizierten System mit einer Abtastrate von 44.100 Hz, normalisiert auf einen Spitzenwert von -1 dB und reduziert auf 48 kHz. Der Voice Activity Detection (VAD)-Algorithmus webRTC wird verwendet, um Audiosegmente zu extrahieren.

4.3. EEG-AUFNAHME, VORVERARBEITUNG UND MERKMALSEXTRAKTION Ruhe-EEG-Daten werden am IRCCS Policlinico San Donato (für Patienten aus UO1) und an der AOU Careggi (Florenz, Italien) (für Patienten aus UO2) erhoben. Das Standard-21-Kanal-System wird verwendet. Die EEG-Aufnahme beginnt mit 10 Minuten bei geschlossenen Augen, gefolgt von abwechselnd 3 Minuten mit offenen Augen und 3 Minuten mit geschlossenen Augen, zweimal wiederholt. Nur die Segmente mit geschlossenen Augen werden für die Analyse verwendet.

4.4. SAMMLUNG, HANDHABUNG UND LAGERUNG VON BIOLOGISCHEN PROBEN Blutproben werden durch Venenpunktion in Standard-Polypropylenröhrchen mit EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) an der Neurologieabteilung des San Donato Polyklinikums und der Neurologieabteilung des Universitätskrankenhauses Careggi entnommen. Gemäß der klinischen Routine für Patienten mit kognitivem Abbau werden nach Einholung der Einwilligung zur Lumbalpunktion Liquorproben um 8 Uhr morgens durch Lumbalpunktion an der Neurologieabteilung des Policlinico San Donato und der Neurologieabteilung des Universitätskrankenhauses Careggi entnommen. Die Proben werden sofort zentrifugiert und bei -80°C gelagert, bis die Analyse durchgeführt wird. Blutproben werden zu zwei Zeitpunkten entnommen: zum Zeitpunkt der ersten klinischen Bewertungen (Basiserhebung) und zwei Jahre nach der ersten Entnahme (Nachuntersuchungserhebung).

Biologische Proben von Patienten aus UO1 und damit verbundene für die Studie gesammelte Daten werden an die BioCor-Biobank am IRCCS Policlinico San Donato zur Verarbeitung und anschließenden Lagerung überführt. Die Proben werden in der BioCor-Biobank für bis zu 25 Jahre gelagert.

Biologische Proben von Patienten aus UO2 und damit verbundene für die Studie gesammelte Daten werden an das Neurogenetik-Labor der AOUC zur Verarbeitung und anschließenden Lagerung überführt. Sie werden innerhalb von zwei Stunden bei 1300 rcf bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, und das Plasma wird isoliert und bei -80°C gelagert, bis zur Analyse.

4.5. ANALYSE VON BLUTBIOMARKERN Die Analyse von Plasmabiomarkern wird an den Proben, die zu Studienbeginn und bei der zweijährigen Nachuntersuchung entnommen wurden, im Neurogenetik-Labor der AOU Careggi unter Verwendung des Simoa-Kits für humane Proben der Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) auf der automatisierten Simoa SR-X-Plattform (GBIO, Hangzhou, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Plasmabiomarkerkonzentrationen aller Proben werden in einem einzigen Durchlauf gemessen. Qualitätskontrollen werden in die Analyse einbezogen und zusammen mit den Proben getestet. Eine Kalibrierungskurve wird durch seriell verdünnte Kalibratormessungen bestimmt, die von Quanterix bereitgestellt werden.

4.6. ANALYSE VON CSF-BIOMARKERN Die Konzentrationen von Aβ42, Aβ40, t-tau und p-tau werden im Neurogenetik-Labor der AOUC unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay-Analysators (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokio, Japan) gemessen. Cut-off-Werte für CSF werden gemäß den von Fujirebio bereitgestellten Richtlinien bestimmt.

4.7. GENETISCHE ANALYSE Genetische Analysen werden im Neurogenetik-Labor der AOUC durchgeführt.

Eine standardisierte automatisierte Methode (QIAcube, QIAGEN) wird verwendet, um DNA aus Blutproben zu isolieren. Die ausgewählten Gene werden wie folgt analysiert:

• APP, PSEN1, PSEN2: Alle kodierenden Exons und Intron/Exon-Grenzen werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern amplifiziert, die mit der Primer3-Software entworfen wurden.
• APOE-Genotypen: APOE-Genotypen werden durch HRMA untersucht. Proben mit bekannten APOE-Genotypen, die durch DNA-Sequenzierung validiert wurden, werden als Standardreferenzen verwendet.

• CAG-Repeat-Expansionen in HTT: Sie werden durch Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikationsassay unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer bestimmt. Die Fragmentgröße wird durch Kapillarelektrophorese unter Verwendung des "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) und der Software GeneMapper Version 4.0 (Applied Biosystems) bestimmt. Ein Satz von HTT-CAG-Allelen, deren Längen durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden, wird als Größenstandard verwendet.

  5. DATENANALYSE

Die Datenanalyse besteht aus den folgenden Schritten:

1. Deskriptive statistische Analyse
2. Training und Testen des maschinellen Lernmodells

5.1. DESKRIPTIVE STATISTISCHE ANALYSE Die Verteilung der Variablen wird mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet. Die Patientengruppen werden unter Verwendung von Mittelwert und Standardabweichung, Medianen und Interquartilsbereichen (IQRs), Häufigkeiten oder Prozenten und 95%-Konfidenzintervallen für kontinuierliche Variablen, nicht normalverteilte kontinuierliche Variablen und kategoriale Variablen charakterisiert. Abhängig von der Datenverteilung verwenden wir ANOVA- oder nichtparametrische Kruskal-Wallis-Tests für Gruppenvergleiche und Pearson- oder Spearman-Korrelationskoeffizienten, um Korrelationen zwischen numerischen Maßen zu bewerten. Chi-Quadrat-Tests werden verwendet, um kategoriale Daten zu vergleichen. Effektstärken werden unter Verwendung von Cohen's d für normalverteilte numerische Maße, η² für den Mann-Whitney-U-Test und Cramer's V-Test für kategoriale Daten berechnet.

5.2. TRAINING UND TESTEN DES MASCHINELLEN LERNMODELLS Wir werden einen Satz multimodaler Merkmale definieren, einschließlich neuropsychologischer Scores, Indikatoren der kognitiven Reserve, Persönlichkeitsmerkmale, EEG-Merkmale, Plasmabiomarker und genetische Varianten. Eine gemeinsame Metrik wird basierend auf der Dispersion jeder Profildimension definiert, und dann trainieren wir einen maschinellen Lernalgorithmus, um jeden Profil-"Vektor" mit Biomarkerprofilen zu assoziieren. Zunächst werden wir diese Klassifikation unter Verwendung standardisierter maschineller Lernverfahren durchführen. In einer separaten Reihe von Analysen werden wir einen Deep-Learning-Ansatz verfolgen, indem wir ein mehrstufiges Feedforward-Künstliches Neuronales Netzwerk (ANN) trainieren, um die CSF-Biomarkerprofile der Patienten vorherzusagen. Das Modell mit der besten Leistung (bewertet durch die AUCs der ROC-Kurven) wird auf dem Testset getestet, um eine unvoreingenommene Schätzung der Modellleistung zu erhalten.

6. STICHPROBENUMFANG Unter der Annahme eines Stichproben-AUC-Werts von 0,8 ermöglicht die von Hanley und McNeil (1982) vorgeschlagene Standardfehlerberechnungsmethode, die Grenzen des Konfidenzintervalls zu bestimmen, mit 40 Patienten in der Gruppe mit Alzheimer-Krankheit (20 %) und 160 in der Gruppe ohne (80 %, Prozentsätze geschätzt aus Daten früherer Studien an der AOU Careggi15), einer Breite von 0,173 (0,713-0,887). Unter sonst gleichen Bedingungen, bei einer angenommenen AUC von 0,9, beträgt das Konfidenzintervall 0,131 (0,834-0,966). Unter Berücksichtigung einer Drop-out-Rate von 20 % ergibt sich die Stichprobe der zu rekrutierenden Probanden auf 250.