Alzheimers sykdoms signatur i subjektiv kognitiv nedgang (SIGN-AL)

1. INNLEDNING Forskning på Alzheimers sykdom (AD) og klinisk praksis er ved et vendepunkt. Ettersom sykdomsmodifiserende terapier (DMT-er) for AD blir tilgjengelige, vil nevrologer, forskere og helsetjenester stå overfor en forutsigbar, økende etterspørsel etter diagnostiske evalueringer for pasienter med kognitiv svikt. I tillegg er det enighet om at DMT-er bør administreres i de tidligste stadiene av sykdommen for å stanse sykdomsprosessen før nevrodegenerasjonen begynner. Av denne grunn fokuserer internasjonal forskning på subjektiv kognitiv svikt (SCD) og mild kognitiv svikt (MCI), som betraktes som de tidligste manifestasjonene av AD og den optimale målgruppen for fremtidige DMT-er. Imidlertid er både MCI og SCD svært vanlige og heterogene tilstander med forskjellige mulige forløp og mange potensielle underliggende årsaker. Nåværende anerkjente biomarkører for sykdommen (hjerne-MR, PET-neurobildeavbildning og cerebrospinalvæske [CSF]-biomarkører) er svært nøyaktige for å identifisere pasienter med SCD og MCI på grunn av Alzheimers sykdom, men deres storskala bruk er ekstremt begrenset på grunn av høye kostnader, dårlig tilgjengelighet og invasivitet.

   Av denne grunn har tidligere studier foreslått å vurdere demografiske, kognitive og genetiske egenskaper for å estimere risikoen for demens. I tillegg anses blodbaserte biomarkører som lovende verktøy for å muliggjøre vurdering på primærhelsetjenestenivå. Imidlertid kan ingen av disse vurderingene eller verktøyene alene garantere tilstrekkelig nøyaktighet til å brukes på screeningsnivå.

2. STUDIETS MÅL

Vi har som mål å:

1. Evaluer nøyaktigheten av mer innovative og lett tilgjengelige biomarkører i de tidligste stadiene av kognitiv nedgang i å forutsi tilstedeværelsen av biologisk diagnostisert AD basert på CSF-biomarkører.
2. Klarlegge nytten av teknikker som allerede er studert i denne sammenhengen, men som har produsert motstridende resultater, som nevropsykologiske skårer og elektroencefalografi (EEG).
3. Utforske nye analyseteknikker som ennå ikke er anvendt på dette feltet, som automatisk analyse av taleopptak (taleanalyse).
4. Evaluer bidraget fra genetiske varianter til AD-risiko hos pasienter med SCD.
5. Kombiner funksjonene og dataene hentet fra disse teknikkene ved hjelp av en maskinlæringstilnærming for å utvikle en prediktiv modell av AD hos pasienter med SCD.

3. STUDIEDESIGN Dette er en multikenter, longitudinell, lavintervensjonsstudie. Pasienter vil bli rekruttert fra U.O.C. of Neurology ved IRCCS Policlinico San Donato (heretter referert til som UO1) og fra Center for Research and Innovation in Dementia (CRIDEM) ved Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi i Firenze, Italia (AOUC, herefter referert til som UO2).

Alle rekrutterte pasienter vil gjennomgå:

1. inngående innsamling av familie- og klinisk historie;
2. omfattende nevropsykologisk evaluering, inkludert språkopptak, estimering av kognitiv reserve, vurdering av depresjon og personlighetstrekk;
3. EEG-opptak i hviletilstand;
4. analyse av følgende blodbiomarkører: Aβ42, Aβ40, p-tau181, p-tau217, t-tau, NfL og GFAP;
5. analyse av følgende gener: PSEN1, PSEN2, APOE, TREM2, ABCA7, BDNF, HTT;
6. analyse av biomarkører i cerebrospinalvæske (CSF): Aβ42, Aβ40, p-tau og t-tau.

3.1. STUDIEPOPULASJON.

Pasienter som oppfyller følgende kriterier vil bli rekruttert:

1. Alder ≥18 år
2. Klinisk diagnose av SCD i henhold til SCD-I-kriteriene4;
3. Mini-Mental State Examination (MMSE)-skår større enn 24, justert for alder og utdanningsnivå;
4. Normal funksjonalitet på Activities of Daily Living (ADL) og Instrumental Activities of Daily Living (IADL)-skalaene.

Pasienter med:

a. Historie med hodetraume; b. Pågående nevrologisk og/eller systemisk sykdom; c. Symptomer på psykose, alvorlig depresjon eller rusmiddelbrukslidelse.

4. STUDIEPROSEDYRE 4.1. NEVROPSYKOLOGISK EVALUERING, VURDERING AV DEPRESJON OG ESTIMERING AV KOGNITIV RESERVE Den inngående nevropsykologiske undersøkelsen vil bli utført ved baseline (innmelding) og ved oppfølging (etter to år) ved IRCCS Policlinico San Donato (for pasienter innmeldt fra UO1) og ved AOU Careggi (for pasienter innmeldt ved UO2) og vil inkludere: globale kognitive mål (Mini Mental State Examination); oppgaver som utforsker verbal og romlig kort- og langtidshukommelse, oppmerksomhet, språk, konstruktiv praksis og eksekutiv funksjon; subjektiv oppfatning av hukommelsesvansker som beskrevet av Mazzeo et al.; indikatorer for kognitiv reserve som premorbid intelligens og fritidsaktiviteter; depressive symptomer; uavhengighetsindeks i daglige aktiviteter; personlighetstrekk.

4.2. OPPTAK OG FORBEHANDLING AV SPRÅK Språkopptak vil skje under Screening for Aphasia in Neurodegeneration (SAND) bildebeskrivelsesoppgave. I et stille og kontrollert miljø vil pasientene bli bedt om å beskrive "Summer Time Picture" etter en standardisert prosedyre. Stemmeopptak vil bli gjort med et dedikert system, med en samplingsfrekvens på 44 100 Hz, normalisert for å nå en topp på -1 dB, og redusert til 48 kHz. Voice Activity Detection (VAD) webRTC-algoritmen vil bli brukt for å ekstrahere lydsegmenter.

4.3. EEG-OPPTAK, FORBEHANDLING OG FUNKSJONSEKSTRAKSJON Hvile-EEG-data vil bli samlet inn ved IRCCS Policlinico San Donato (for pasienter innmeldt fra UO1) og ved AOU Careggi (Firenze, Italia) (for pasienter innmeldt ved UO2). Det standard 21-kanalers systemet vil bli brukt. EEG-opptak vil begynne med 10 minutter med lukkede øyne, etterfulgt av vekslende 3 minutter med åpne øyne og 3 minutter med lukkede øyne, gjentatt to ganger. Bare lukkede øyne-segmenter vil bli brukt til analyse.

4.4. INNSAMLING, HÅNDTERING OG LAGRING AV BIOLOGISKE PRØVER Blodprøver vil bli samlet inn ved venepunksjon i standard polypropylenrør med EDTA (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) ved Nevrologiavdelingen ved San Donato Polyklinikk og Nevrologiavdelingen ved Universitetssykehuset i Careggi. I henhold til klinisk rutine for pasienter med kognitiv nedgang, etter å ha innhentet informert samtykke for rachicentes, vil CSF-prøver bli samlet inn klokken 08.00 ved lumbalpunksjon ved Nevrologiavdelingen ved Policlinico San Donato og Nevrologiavdelingen ved Careggi Universitetssykehus. Prøver vil umiddelbart bli sentrifugert og lagret ved -80°C til analysen utføres. Blodprøver vil bli samlet inn på to tidspunkter: ved tiden for de første kliniske vurderingene (baseline-innsamling) og to år etter den første innsamlingen (oppfølgingsinnsamling).

Biologiske prøver fra pasienter innmeldt ved UO1 og tilknyttede data innsamlet for studien vil bli overført til BioCor Biobank ved IRCCS Policlinico San Donato for behandling og påfølgende lagring. Prøver vil bli lagret ved BioCor Biobank i opptil 25 år.

Biologiske prøver fra pasienter innmeldt ved UO2 og tilknyttede data innsamlet for studien vil bli overført til AOUC Neurogenetics-laboratoriet for behandling og påfølgende lagring. De vil bli sentrifugert innen to timer ved 1300 rcf ved 4°C i 10 minutter, og plasmaet vil bli isolert og lagret ved -80°C til analysen.

4.5. ANALYSE AV BLODBIOMARKØRER Analyse av plasmabiomarkører vil bli utført på prøvene tatt ved baseline og to-års oppfølgingsprøver ved AOU Careggi Neurogenetics-laboratoriet ved bruk av Simoa-kittet for humane prøver levert av Quanterix Corporation (Lexington, MA, USA) på den automatiserte Simoa SR-X-plattformen (GBIO, Hangzhou, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner. Plasmabiomarkørkonsentrasjoner for alle prøver vil bli målt i en enkelt kjøring. Kvalitetskontroller vil bli inkludert i analysen og testet sammen med prøvene. En kalibreringskurve vil bli bestemt av serielt fortynnede kalibratormålinger levert av Quanterix.

4.6. ANALYSE AV CSF-BIOMARKØRER Konsentrasjoner av Aβ42, Aβ40, t-tau og p-tau vil bli målt ved AOUC Neurogenetics-laboratoriet ved bruk av en kemiluminescent enzymimmunoassay-analysator (CLEIA) LUMIPULSE G600 (Fujirebio, Tokyo, Japan). Grenseverdier for CSF vil bli bestemt i henhold til retningslinjene levert av Fujirebio.

4.7. GENETISK ANALYSE Genetiske analyser vil bli utført ved AOUC Neurogenetics-laboratoriet.

En standard automatisk metode (QIAcube, QIAGEN) vil bli brukt for å isolere DNA fra blodprøver. De utvalgte genene vil bli analysert som følger:

• APP, PSEN1, PSEN2: Alle kodende eksoner og intron/ekson-grenser vil bli amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) ved bruk av primere designet med Primer3-programvare.
• APOE-genotyper: APOE-genotyper vil bli undersøkt ved HRMA. Prøver med kjente APOE-genotyper validert gjennom DNA-sekvensering vil bli brukt som standardreferanser.

• CAG-repeat-ekspansjoner i HTT: De vil bli bestemt ved polymerasekjedereaksjonsamplifiseringstest, ved bruk av fluorescerende merket primere. Fragmentstørrelse vil bli bestemt ved kapillærelektroforese ved bruk av "SeqStudio Genetic Analyzer" (ThermoFisher) og GeneMapper versjon 4.0-programvare (Applied Biosystems). Et sett med HTT CAG-alleler, hvis lengder vil bli bekreftet ved DNA-sekvensering, vil bli brukt som størrelsestandard.

  5. DATAANALYSE

Dataanalyse vil bestå av følgende trinn:

1. Deskriptiv statistisk analyse
2. Trenings- og testing av maskinlæringsmodellen

5.1. DESKRIPTIV STATISTISK ANALYSE Fordelingen av variabler vil bli evaluert ved bruk av Shapiro-Wilk-testen. Pasientgruppene vil bli karakterisert ved bruk av gjennomsnitt og standardavvik, medianer og interkvartilområder (IQR-er), frekvenser eller prosenter og 95% konfidensintervaller for henholdsvis kontinuerlige variabler, ikke-normalfordelte kontinuerlige variabler og kategoriske variabler. Avhengig av datadistribusjonen vil vi bruke ANOVA eller ikke-parametriske Kruskal-Wallis-tester for sammenligninger mellom grupper, og Pearsons eller Spearmans korrelasjonskoeffisient for å vurdere korrelasjoner mellom numeriske mål. Chi-kvadrat-tester vil bli brukt til å sammenligne kategoriske data. Effektstørrelser vil bli beregnet ved bruk av Cohens d for normalfordelte numeriske mål, η² for Mann-Whitneys U-test, og Cramers V-test for kategoriske data.

5.2. TRENINGS- OG TESTING AV MASKINLÆRINGSMODELLEN Vi vil definere et sett med multimodale funksjoner inkludert nevropsykologiske skårer, indikatorer for kognitiv reserve, personlighetstrekk, EEG-funksjoner, plasmabiomarkører og genetiske varianter. En felles metrikk vil bli definert basert på spredningen av hver profildimensjon, og deretter vil vi trene en maskinlæringsalgoritme for å assosiere hver profil "vektor" med biomarkørprofiler. I utgangspunktet vil vi utføre denne klassifiseringen ved bruk av standard maskinlæringsprosedyrer. I et separat sett med analyser vil vi følge en dyp læringstilnærming ved å trene et flernivå feedforward kunstig nevralt nettverk (ANN) for å forutsi pasientenes CSF-biomarkørprofiler. Modellen med den beste ytelsen (som vurdert av AUC-ene til ROC-kurvene) vil bli testet på testsettet for å oppnå et upartisk estimat av modellens ytelse.

6. UTVALGSSTØRRELSE Forutsatt en utvalgs-AUC-verdi på 0,8, vil standardfeilberegningsmetoden foreslått av Hanley og McNeil (1982) tillate grensene for konfidensintervallet å bestemmes, med 40 pasienter i gruppen med Alzheimers sykdom (20%) og 160 i gruppen uten (80%, prosenter estimert fra data fra tidligere studier utført ved AOU Careggi15), med bredde 0,173 (0,713-0,887). Alt annet likt, forutsatt en AUC på 0,9, vil konfidensintervallet være 0,131 (0,834-0,966). Med tanke på en frafall på 20%, resulterer utvalget av personer som skal innmeldes i 250.