自閉症スペクトラム障害における腸管血管バリアとマイクロバイオータの役割 (DSA/GVB)

消化器症状の有無は、募集時（T0）にGI重症度指数を使用して評価されます。

募集された被験者は、プロバイオティクスベースのサプリメントであるPostbiotiX Comfort®を1日1回、1か月間摂取します。

GI重症度指数は、治療終了後1週間以内（T1）に腸内環境の変化を定量化するため、および治療終了後1か月後（T2）に観察された変化の安定性を評価するために繰り返されます。

標準化された行動評価は、プロバイオティクス後の補給が睡眠調節に及ぼす効果を評価するために、保護者／介護者による報告式質問票を通じて実施されます。 睡眠障害は、睡眠開始と維持に関する困難、呼吸性睡眠障害、覚醒障害、覚醒・睡眠移行、過度の日中の眠気、および夜間多汗症に関連する問題を調査するために設計された検証済みの評価ツールを用いて評価されます。

睡眠調節は、イタリア語版の小児用睡眠障害尺度を用いて評価されます。 この尺度は、5段階のリッカート尺度（1＝決してない；2＝時々；3＝たまに；4＝よく；5＝常に）で評価される26項目で構成されています。 総合スコアは26から130の範囲で、スコアが高いほど睡眠障害の重症度が高いことを示します。

評価は3つの時点で実施されます：ベースライン（T0）、介入研究への登録時；治療後（T1）、治療終了後1週間以内；および追跡調査（T

行動調整におけるプロバイオティクス後発酵産物サプリメントの効果を評価するため、保護者・介護者による報告アンケートを用いた標準化された行動評価を実施します。 情緒的および行動的調整は、内面化症状および外面化症状を含む情緒的・行動的問題の存在と重症度を調査するために設計された妥当性確認済みの測定機器を用いて評価されます。

行動的および情緒的問題は、年齢に応じた子どもの行動チェックリスト（CBCL）のイタリア語版を用いて評価されます。 この測定機器は、3段階のリッカート尺度（0 = 全く当てはまらない；1 = 少し当てはまる、または時々当てはまる；2 = 非常によく当てはまる、または頻繁に当てはまる）で評価される項目で構成されています。 高いスコアは、情緒的および行動的問題の重症度が高いことを示します。 生スコアは、標準化されたTスコア（平均 = 50、標準偏差 = 10）に変換されます。

評価は3つの時点で実施されます：介入研究への登録時のベースライン（T0）、治療後（T1）

標準化された行動評価は、ポストバイオティクス補給が感覚プロファイルに与える影響を評価するために、親／介護者から報告された質問票を通じて実施されます。

感覚プロファイルは、3〜8歳の子供の親／介護者が記入する感覚プロファイル-2（イタリア語版）を使用して評価されます。 この質問票は、感覚機能、自己調整行動反応、環境感覚刺激に対する行動反応の頻度を評価します。 各感覚領域について生スコアが計算され、スコアが高いほど典型的な感覚処理パターンからの逸脱が大きいことを示します。

評価は3つの時点で実施されます：ベースライン（T0）、介入研究への登録時；治療後（T1）、治療終了後1週間以内；およびフォローアップ（T2）、治療終了後1か月以内で、観察された変化の安定性を評価します。 親／介護者が記入したすべての質問票は、その後

対照群および、胃腸症状の有無にかかわらずASDを有する小児から得られた糞便サンプル。後者の群については、サプリメント療法開始前（T0）および治療後（T1）の両方でサンプルを収集します。

糞便内細菌叢の分類学的および機能的プロファイリングは、浅いショットガンメタゲノムシーケンシングを用いて実施します。全細菌DNAを糞便サンプルから抽出し、Illuminaプラットフォームを用いてシーケンシングを行います。分類学的解析は、種レベルゲノムビン（SGB）解像度（第8分類階級）で実施します。機能的解析は、層別化解除された遺伝子ファミリーおよび代謝経路の存在量に基づき、経路アノテーションはMetaCycデータベースに対して実施します。差次的発現解析（DAA）は、相対存在量として表される分類学的プロファイル、およびコピー数/百万（CPM）に正規化された遺伝子ファミリーおよび経路プロファイルに対して実施します。測定単位：細菌分類群の相対存在量（%）

対照群および胃腸症状の有無にかかわらず自閉スペクトラム症（ASD）の小児から得られた糞便サンプルに対して以下の臨床検査を実施します。 後者の群については、サプリメント治療開始前（T0）と治療後（T1）の両方でサンプルを採取します。 糞便サンプルに対して非標的メタボロミクス解析を行い、細菌由来の代謝物を同定します。 代謝物は液体クロマトグラフィー-質量分析法（LC-MS）およびガスクロマトグラフィー-質量分析法（GC-MS）を用いて検出・定量し、その後バイオインフォマティクス解析を実施します。

測定単位：

• 代謝物の相対的または絶対的豊度（正規化ピーク強度／濃度）

対照被験者および胃腸症状の有無にかかわらずASDを有する小児から得られた糞便サンプルについて、以下の検査を実施します。 後者のグループについては、サプリメント療法開始前（T0）および治療後（T1）の両方でサンプルを採取します。 腸管透過性は、市販の酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いてゾヌリンとアルブミンの糞便中濃度を定量することにより評価します。 糞便中ゾヌリン濃度の上昇は、タイトジャンクションの分解と上皮透過性の亢進を示すものと解釈します。 糞便中アルブミン濃度の上昇は、腸管粘膜を介した炎症性漏出に関連する腸管バリア機能障害のマーカーと解釈します。 両方のバイオマーカーは、腸管透過性および腸管バリア完全性の変化の指標として分析されます。

測定単位：

• ゾヌリンファミリーペプチド：濃度（例：ng/mLまたはng/g糞便）
• アルブミン：濃度（例：ng/mL

自閉症スペクトラム障害（ASD）の小児におけるメタゲノムおよびメタボロームプロファイルと行動・消化器転帰との関係を調査するために、相関分析を実施します。 この初期分析により、ポストバイオティクス治療によって潜在的に調整される微生物多様性、代謝産物の豊富さ、および臨床指標間の有意な関連性の特定が可能になります。

次に、メタゲノム、メタボローム、および腸管透過性データを、高度な計算マルチオミクスアプローチを用いて行動転帰と統合します。 標準化されたパイプラインによるデータ正規化および調整後、メタゲノムおよびメタボロームデータセットは、ネットワークベースの統合戦略および正準相関分析（CCA）、スパース部分最小二乗法（sPLS）、マルチオミクス因子分析（MOFA）などの多変量手法を使用して結合され、共有される機能シグネチャ、主要な微生物-代謝相互作用、およびデータセット全体の収束経路を特定します。

クロス