Rola bariery naczyniowej jelit i mikrobioty w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (DSA/GVB)

Obecność objawów żołądkowo-jelitowych będzie oceniana podczas rekrutacji (T0) przy użyciu Indeksu Nasilenia Objawów Żołądkowo-Jelitowych.

Zrekrutowani uczestnicy będą leczeni suplementem diety na bazie postbiotyku, PostbiotiX Comfort®, raz dziennie przez 1 miesiąc.

Indeks Nasilenia Objawów Żołądkowo-Jelitowych będzie powtórzony w ciągu tygodnia po zakończeniu leczenia (T1) w celu ilościowego określenia zmian w regulacji jelit oraz miesiąc po zakończeniu leczenia (T2) w celu oceny stabilności zaobserwowanych zmian.

Standaryzowane oceny behawioralne będą prowadzone za pomocą kwestionariuszy wypełnianych przez rodziców/opiekunów w celu oceny wpływu suplementacji postbiotyków na regulację snu. Zaburzenia snu będą oceniane za pomocą zwalidowanych narzędzi zaprojektowanych do badania trudności związanych z zasypianiem i utrzymaniem snu, zaburzeniami oddychania podczas snu, zaburzeniami pobudzenia, przejściami między czuwaniem a snem, nadmierną sennością dzienną oraz nocną nadpotliwością.

Regulacja snu będzie oceniana za pomocą włoskiej wersji Skali Zaburzeń Snu u Dzieci. Skala składa się z 26 pozycji ocenianych w 5-stopniowej skali Likerta (1 = nigdy; 2 = sporadycznie; 3 = czasami; 4 = często; 5 = zawsze). Łączny wynik surowy mieści się w zakresie od 26 do 130 punktów, przy czym wyższe wyniki wskazują na większe nasilenie zaburzeń snu.

Oceny będą prowadzone w trzech punktach czasowych: na początku badania (T0), przy włączeniu do badania interwencyjnego; po leczeniu (T1), w ciągu tygodnia po zakończeniu leczenia; oraz w trakcie obserwacji po leczeniu (T

Standaryzowane oceny behawioralne będą przeprowadzane za pomocą kwestionariuszy wypełnianych przez rodziców/opiekunów w celu oceny wpływu suplementacji postbiotykowej na regulację zachowania. Regulacja emocjonalna i behawioralna będzie oceniana za pomocą zwalidowanych instrumentów zaprojektowanych do badania występowania i nasilenia problemów emocjonalnych i behawioralnych, w tym objawów internalizacyjnych i eksternalizacyjnych.

Problemy behawioralne i emocjonalne będą oceniane przy użyciu włoskich wersji Child Behavior Checklist (CBCL) odpowiednich dla wieku. Instrument składa się z pozycji ocenianych na 3-punktowej skali Likerta (0 = nieprawda; 1 = częściowo lub czasami prawda; 2 = bardzo prawdziwe lub często prawdziwe). Wyższe wyniki wskazują na większe nasilenie problemów emocjonalnych i behawioralnych. Wyniki surowe zostaną przeliczone na standaryzowane wyniki T (średnia = 50, odchylenie standardowe = 10).

Oceny będą przeprowadzane w trzech punktach czasowych: wyjściowo (T0), przy włączeniu do badania interwencyjnego; po leczeniu (T1)

Znormalizowane oceny behawioralne będą prowadzone za pomocą kwestionariuszy wypełnianych przez rodziców/opiekunów w celu oceny wpływu suplementacji postbiotyków na profil sensoryczny.

Profil sensoryczny będzie oceniany przy użyciu Sensory Profile-2 (wersja włoska), wypełnianego przez rodziców/opiekunów dla dzieci w wieku 3-8 lat. Kwestionariusz ocenia funkcjonowanie sensoryczne, reakcje behawioralne związane z samoregulacją oraz częstotliwość reakcji behawioralnych na sensoryczne bodźce środowiskowe. Dla każdej domeny sensorycznej obliczane są surowe wyniki; wyższe wyniki wskazują na większe odchylenie od typowych wzorców przetwarzania sensorycznego.

Oceny będą przeprowadzane w trzech punktach czasowych: punkt wyjściowy (T0), przy włączeniu do badania interwencyjnego; po leczeniu (T1), w ciągu tygodnia po zakończeniu leczenia; oraz w punkcie kontrolnym (T2), w ciągu miesiąca po zakończeniu leczenia w celu oceny stabilności zaobserwowanych zmian. Wszystkie kwestionariusze wypełnione przez rodziców/opiekunów będą następnie omawiane z

Próbki kału pobrane od osób kontrolnych oraz dzieci z ASD z objawami ze strony przewodu pokarmowego i bez nich. W przypadku tej drugiej grupy próbki będą zbierane zarówno przed rozpoczęciem terapii suplementacyjnej (T0), jak i po leczeniu (T1).

Profilowanie taksonomiczne i funkcjonalne mikrobiomu kałowego zostanie przeprowadzone przy użyciu płytkiego sekwencjonowania metagenomicznego typu shotgun. Całkowite DNA bakteryjne zostanie wyizolowane z próbek kału i zsekwencjonowane przy użyciu platform Illumina. Analizy taksonomiczne będą przeprowadzane w rozdzielczości Species-level Genome Bin (SGB) (ósmy rang taksonomiczny). Analizy funkcjonalne będą oparte na destratyfikowanych obfitościach rodzin genów i szlaków metabolicznych, z adnotacją szlaków przeprowadzoną w odniesieniu do bazy danych MetaCyc. Analizy różnicowej obfitości (DAAs) będą przeprowadzane na profilach taksonomicznych wyrażonych jako względne obfitości oraz na profilach rodzin genów i szlaków znormalizowanych do kopii na milion (CPM). Jednostka miary: względna obfitość taksonów bakteryjnych (%)

Następujące badania laboratoryjne zostaną przeprowadzone na próbkach kału pobranych od osób kontrolnych oraz dzieci z ASD z objawami ze strony przewodu pokarmowego i bez nich. W przypadku tej ostatniej grupy, próbki będą zbierane zarówno przed rozpoczęciem terapii suplementacyjnej (T0), jak i po leczeniu (T1). Nieukierunkowana analiza metabolomiczna zostanie przeprowadzona na próbkach kału w celu identyfikacji metabolitów pochodzenia bakteryjnego. Metabolity zostaną wykryte i skwantowane przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS) oraz chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS), a następnie poddane analizie bioinformatycznej.

Jednostka miary:

• Względna lub bezwzględna obfitość metabolitów (znormalizowana intensywność pików/stężenie)

Następujące badania laboratoryjne zostaną przeprowadzone na próbkach kału pobranych od osób z grupy kontrolnej oraz dzieci z ASD, z objawami ze strony przewodu pokarmowego i bez nich. W przypadku tej drugiej grupy próbki będą pobierane zarówno przed rozpoczęciem terapii suplementacyjnej (T0), jak i po leczeniu (T1). Przepuszczalność jelit zostanie oceniona poprzez ilościowe oznaczenie poziomów zonuliny i albuminy w kale przy użyciu dostępnych komercyjnie testów immunoenzymatycznych (ELISA). Podwyższony poziom zonuliny w kale będzie interpretowany jako wskazujący na rozpad połączeń ścisłych i zwiększoną przepuszczalność nabłonka. Podwyższone stężenie albuminy w kale będzie interpretowane jako marker dysfunkcji bariery jelitowej związanej ze stanem zapalnym i przesiąkaniem przez błonę śluzową jelita. Oba biomarkery będą analizowane jako wskaźniki zmienionej przepuszczalności jelit i integralności bariery jelitowej.

Jednostka miary:

• Peptydy z rodziny zonuliny: stężenie (np. ng/ml lub ng/g kału)
• Albumina: stężenie (np. ng/ml)

Analizy korelacji zostaną przeprowadzone w celu zbadania związków między profilami metagenomicznymi i metabolomicznymi a wynikami behawioralnymi i żołądkowo-jelitowymi u dzieci z ASD. Ta wstępna analiza umożliwi identyfikację istotnych związków między różnorodnością mikrobiologiczną, obfitością metabolitów i miarami klinicznymi potencjalnie modulowanymi przez leczenie postbiotyczne.

Dane metagenomiczne, metabolomiczne i dotyczące przepuszczalności jelitowej zostaną następnie zintegrowane z wynikami behawioralnymi przy użyciu zaawansowanych obliczeniowych podejść multi-omikowych. Po normalizacji i harmonizacji danych za pomocą znormalizowanych potoków, zbiory danych metagenomicznych i metabolomicznych zostaną połączone przy użyciu strategii integracji opartych na sieciach oraz metod wielowymiarowych, w tym analizy korelacji kanonicznej (CCA), rzadkich częściowych najmniejszych kwadratów (sPLS) oraz wieloczynnikowej analizy multi-omikowej (MOFA), w celu identyfikacji wspólnych sygnatur funkcjonalnych, kluczowych interakcji mikrobiologiczno-metabolicznych i zbieżnych szlaków w różnych zbiorach danych.

Krzyż