난포액의 산화질소(NO)와 정자 수정 능력의 관계
여러 연구에 따르면 산화질소(NO)는 포유동물의 생식계 생리학에서 중요한 역할을 합니다. NO는 정자 운동성에 영향을 미치고, 다양한 정자 단백질의 티로신 인산화를 조절하고, 투명대에 대한 정자 결합 능력을 향상시키고, 첨체 반응을 조절하는 것으로 나타났습니다.
NO 합성을 담당하는 효소인 NOS(Nitric Oxide Synthase)는 난모세포, 난구 및 코로나 세포뿐만 아니라 난관에서도 확인되었습니다. 이러한 이유로 수정 부위의 NOS 존재는 이 과정의 성공을 결정하는 핵심 요소가 될 수 있습니다. 따라서, 수정 과정, 특히 인간 정자 수용 능력에서 산화질소의 역할을 더 잘 이해하기 위한 시험관 내 연구를 수행하면 불임 진단과 예후 모두의 개선으로 인해 보조 생식 기술(ART)의 결과를 개선할 수 있습니다. 치료 성공.
이 연구는 수의학부(스페인 무르시아 대학교)의 동물 생리학과와 공동으로 수행되며 Horizon 2020 프로그램에 따라 유럽 위원회의 자금 지원을 받습니다.
연구 개요
상태
상태
정황
정황
개입 / 치료
개입 / 치료
상세 설명
주요 목적:
인간 여포액(hFF)의 존재/부재에서 정자 용량화 배지에 NO 합성 기질인 L-아르기닌을 추가할 때 비옥한 환자와 불임 환자의 NOS 발현 및 단백질 니트로실화의 변화를 확인합니다.
보조 목표:
- 정자 수용 능력에 대한 hFF의 효과가 체액의 NO 수준과 관련이 있는지 조사합니다.
hFF의 NO 수준과 ART의 임상 결과 사이의 상관관계를 확인합니다.
방법론
A. 인구 연구에 포함된 인구는 체외 수정 기술을 통한 보조 생식 치료를 위해 IVI Murcia 클리닉에 참석하는 정액 기증자와 커플로 구성됩니다.
B. 포함/제외 기준 모집단과 포함 및 제외 기준은 목적에 따라 다를 수 있습니다.
포함 기준 주요 목표
가임 환자와 난임 환자에서 단백질 니트로실화뿐만 아니라 NOS 발현의 변형을 조사합니다. 이를 위해 다음 그룹을 모집합니다.
- 클리닉 IVI Murcia에 참석하는 정액 기증자와 같은 가임 남성 그룹;
- 체외 수정 치료를 받기 위해 IVI Murcia 클리닉에 참석하고 WHO(2010) 지침에 따라 하나의 변경된 정자도 매개변수를 가진 환자로 구성된 난임 남성 그룹.
2차 목표에 도달하기 위해 IVF 또는 ICSI 치료를 받는 부부가 포함됩니다.
제외기준 착상전 유전진단을 받은 부부, 반복유산(20주 이전에 3회 이상 연속유산) 또는 착상실패(36세 미만 여성에게 양질의 배아를 3회 이식한 후 임신부족, 또는 36세 이상의 여성에서 2번의 배아 이식 후), 40세 이상의 여성.
C. 샘플 크기:
NOS 발현에 대한 기준값을 사용할 수 없고 진행성 정자 분포의 변동성이 높기 때문에 양측 검사에서 평균 대비 20%의 차이를 감지하는 것이 중요하다고 판단되었습니다. 통계력의 5%와 80%, 그룹당 41개의 정액 샘플이 필요합니다. 24개월의 기간이 정액 샘플의 수에 도달하는 것으로 추정됩니다.
D. 실험 설계 및 개입 대조군(가임기 정액 기증자)과 실험군(난임 남성)을 대상으로 한 생물 의학 연구
개입:
정액 샘플: 2~7일 간의 금욕 후 자위행위로 채취합니다. 모든 샘플은 WHO 지침(2010)에 따라 분석됩니다. 연구에 포함된 남성에 대한 불필요한 방문을 피하기 위해 클리닉 방문 중 정액 샘플이 요청됩니다.
정자는 hFF의 유무에 따라 능력을 발휘합니다. 첫 번째 실험 세트에서 hFF는 L-아르기닌과 NOS 억제제 L-NAME으로 보충됩니다. 실험의 또 다른 세트에서 정전용량 매질에 대한 동일한 보충이 검사되지만 hFF를 사용하지 않습니다.
Western blot, in situ nitrosylation 및 Biotin Switch Assay와 같은 일련의 기술을 사용하여 정자에서 NOS 발현 및 단백질 nitrosylation의 변화를 결정합니다. 웨스턴 블롯 기술은 단백질 키나제 A(PKA) 활성, 티로신 인산화 및 티로신 니트로화와 같은 다른 정전용량 마커를 평가하는 데에도 적용됩니다. 환자에게서 왔든 정액 기증자에게서 왔든 관계없이 모든 정액 샘플에 대해 동일한 치료가 수행됩니다. 어떤 경우에도 이러한 정액 샘플은 보조 생식 치료를 수행하는 데 사용되지 않습니다.
인간 난포액 샘플:
난포액 내 NO 농도와 보조 생식 치료의 성공 사이의 상관관계를 연구하기 위해 난자 채취 절차 중에 난포액 샘플을 채취합니다. 난모세포 제거 후 이러한 체액은 일반적으로 제거되지만 이 경우 체액은 2000g에서 10분 동안 원심분리되고 평가될 때까지 -20°C에서 보관됩니다.
NO 농도는 상업적으로 이용 가능한 측정 시스템의 도움으로 결정됩니다. NO는 2개의 안정한 이온, 즉 아질산염과 질산염으로 빠르게 산화되며 이온 선택 전극을 사용하여 분석할 수 있습니다. 이 전극은 두 종 모두에 대해 낮은 μM 범위까지 검출 한계가 있는 30-40 μl까지 샘플을 측정할 수 있도록 소형화되었습니다.
웨스턴 블롯 및 단백질 니트로실화 분석은 무르시아 대학교(수의학부)의 동물 생리학 실험실 내에서 수행될 것입니다.
난포액 분석의 유일한 목적은 보조 생식 치료 후 치료 결과와 NO 수준 사이에 상관 관계가 있는지 조사하는 것입니다. 어떤 경우에도 난포액의 NO 수치에 따라 배아 이식 결정을 내리지 않습니다.
E. 생물학적 샘플 수집 정자와 난포액 샘플은 본 연구에서 평가될 것입니다.
- 샘플 수집의 목적 본 연구에서 수집된 샘플은 연구 프로젝트 완료를 위해서만 사용됩니다. 각 생물학적 샘플에는 환자의 NHC 코드(임상 병력 수)와 독립적인 코드가 할당되며 연구팀만 알 수 있습니다. Juan Carlos Martínez Soto 박사는 생물학적 샘플의 보관 및 보관을 담당할 것입니다.
- 샘플 수집 방법 생물학적 샘플은 환자가 해당 정보에 입각한 동의서에 서명한 후에만 얻을 수 있습니다. 정자 샘플은 2~7일 간의 금욕 후 자위 행위로 채취합니다. 불필요한 변위를 피하기 위해 샘플 수집은 환자가 진료소를 방문하는 동안 이루어집니다.
난포액 샘플은 환자가 따를 체외 수정 치료를 위해 수행되는 난자 채취 절차 당일에 채취됩니다. 일반적으로 폐기되는 이 유체는 NO 값을 결정하는 데만 사용됩니다.
이 난포액을 얻는 것은 난자 채취 수술 절차를 사용하여 난포액을 얻기 때문에 생식 치료로 인한 추가적인 위험이나 불편함이 없습니다.
- 샘플 식별 방법 정액 및 난포액 샘플은 참가자의 신원을 보호할 수 있는 방식으로 식별됩니다.
- 샘플 보존 정액 및 난포액 샘플은 Juan Carlos Martínez Soto 박사의 감독 하에 추가 처리될 때까지 -80°C에서 Andrology 실험실(IVI Murcia)의 냉동고에 보관됩니다. 무르시아 대학교로 보내진 샘플은 Carmen Matás Parra 박사가 보관합니다. 무르시아 대학교 시설과 IVI 클리닉 시설 모두 접근이 제한되어 있으므로 샘플을 항상 보호해야 합니다. 연구가 완료되면(2019년 1월) 잉여 샘플은 클리닉의 일반적인 프로토콜에 따라 파기됩니다.
F. 데이터베이스 샘플 분석(난포액 및 정액 샘플)에 관한 데이터는 IVI Murcia 시설의 Excel 테이블에 저장됩니다. 연구에 포함된 환자가 따라온 보조 생식 치료의 결과에 관한 데이터는 IVI 관리 시스템(SIVIS)에서 얻을 것입니다.
G. 연구 변수
네 가지 변수 클래스는 연구 내 관련성에 따라 구분됩니다.
1차 변수: 수준 없음.
2차 변수: NOS 발현, 진행성 정자 비율, 임신율, 생화학적 임신, 임신 진화, 착상율, 자궁외 임신율.
제어 변수: 티로신 인산화(광학 밀도 단위), PKA(광학 밀도 단위), 단백질 니트로실화(광학 밀도 단위), 질산염 및 아질산염(마이크로몰 단위).
설명 변수: 산모 연령, 부계 연령, 남성 병인, 여성 병인, BMI, 흡연 습관.
H. 데이터 분석
기술 분석:
연구에서 수집된 데이터의 통계적 요약. 범주형 데이터는 빈도표와 히스토그램으로 표시됩니다. 연속 값은 평균, 표준 편차 및 신뢰 구간으로 요약되며 사분위수 또는 밀도 그래프로 표시됩니다.
데이터의 탐색적 분석을 통해 데이터의 품질과 이상 감지를 평가할 수 있습니다.
균질성 분석:
기술 변수(기준선 및 인구통계학적)의 평균 및 비율을 비교하여 연구 그룹의 비교 가능성 정도를 확인합니다. S 카이제곱 테스트는 범주형 변수에 적용되고 데이터가 정규 분포를 따른다고 가정하면 연속 변수에 T-테스트가 적용됩니다. 데이터가 정규 분포를 따르지 않으면 Mann-Whitney 검정이 적용됩니다.
그룹 간에 통계적 차이가 있는 방식으로 분포된 설명 변수를 찾는 경우 연구 대상 주요 관계에서 간섭을 제어하기 위해 회귀 모델에 포함됩니다.
NO 발현의 비교:
NO 표현에서 비율의 상관 관계에 대한 가설을 검증하기 위해 Fisher 테스트가 적용됩니다.
NO 발현의 행동을 수정할 수 있는 다른 공변량의 효과를 평가하기 위해 로지스틱 회귀 모델이 정의됩니다.
단백질 니트로실화의 비교는 데이터가 정규분포를 따른다고 가정하고 Student's t-test를 적용한다. Kolmogorov-Smirnof 테스트로 확인된 정규성 가정이 충족되지 않으면 비모수 U-MannWhitney 테스트가 적용됩니다.
같은 방식으로 다른 상관 변수의 효과를 평가할 수 있는 선형 회귀 모델이 정의됩니다.
정액의 질 평가:
정액 품질을 구성하는 변수 세트의 경우 데이터가 정규 분포를 따른다고 가정하여 t-Student 테스트가 적용됩니다. Kolmogorov-Smirnof 테스트로 확인된 정규성 가정이 충족되지 않으면 비모수 U-MannWhitney 테스트가 적용됩니다.
임신 결과 평가:
임신 결과를 정의하는 변수 세트의 경우 Fisher 테스트가 적용됩니다.
업무 계획:
전체 연구 팀의 개발 단계 및 작업 분배 및 기술 직원을 위해 계획된 과제. 프로젝트 구현의 추가 장소/중심을 표시합니다.
연구 설계 및 프로젝트 초안 작성은 Carmen Matás Parra 의사와 Juan Carlos Martínez Soto 의사가 수행했습니다.
IVI Murcia 클리닉의 생식 의학 부서를 구성하는 산부인과 전문의 팀인 Jose Landeras 박사, María Nicolás, Laura Fernández 및 Martina Trabalón은 연구에 환자와 정액 기증자를 포함시키는 일과 환자에게 수행되는 보조 생식 치료에 대한 직접적인 책임이 있습니다. 이러한 치료에는 수행할 치료 선택, 난소 자극, 난모세포 및 난포액을 수집하기 위한 난모세포 채취 절차 및 배아 이식이 포함됩니다.
배아학자인 Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho 및 Ana Isabel Sanchez는 수정 실험실에서 난자 수정 과정과 이식할 배아 선택을 담당하게 됩니다.
Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra 및 Juan Carlos Martínez Soto가 정액 및 난포액 샘플을 모두 분석합니다. 이러한 분석은 IVI Murcia 클리닉의 시설과 Murcia 대학의 실험실 모두에서 수행됩니다.
Jorge Chavarro 박사는 역학 및 생물통계 연구를 수행할 것입니다.
연구 유형
연구 유형
등록 (예상)
등록
단계
단계
- 해당 없음
연락처 및 위치
연구 연락처
연구 연락처
- 이름: Carmen Matas Parra, Professor
- 전화번호: +34669031210
- 이메일: cmatas@um.es
연구 장소
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-
Murcia, 스페인, 30007
- 모병
- IVI Murcia
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참여기준
자격 기준
자격 기준
공부할 수 있는 나이
건강한 자원 봉사자를 받아들입니다
연구 대상 성별
설명
포함 기준:
- 이 연구에는 IVI Murcia 클리닉에 참석하는 정액 기증자와 같은 가임 남성과 체외 수정 치료를 받기 위해 클리닉에 참석하고 하나의 변경된 정자도 매개 변수를 소유한 환자로 구성된 난임 남성 그룹이 포함됩니다(WHO 2010에 따름). 가이드라인). 이 참가자들은 비옥한 남성과 난임 남성의 단백질 니트로실화뿐만 아니라 NOS 발현의 변형을 조사하기 위해 모집될 것입니다.
- 이 연구는 또한 IVF 또는 ICSI 치료를 받는 커플을 포함하여 정자 수용 능력에 대한 인간 난포액의 영향이 유체 내 NO 수준과 관련이 있는지 조사하고 난포액 내 NO 수준과 ART의 임상 결과.
제외 기준:
- 착상 전 유전진단을 받은 부부, 반복유산(20주 이전에 3회 이상 연속 유산) 또는 착상실패(36세 미만 여성에서 양질의 배아로 3회 이식 후 임신부족) 진단을 받은 부부는 본 연구에서 제외됩니다. 또는 36세 이상의 여성에서 두 번의 배아 이식 후), 40세 이상의 여성.
공부 계획
연구는 어떻게 설계됩니까?
디자인 세부사항
- 주 목적: 특수 증상
- 할당: NON_RANDOMIZED
- 중재 모델: 평행한
- 마스킹: 없음
팔의 수
무기와 개입
참가자 그룹 / 팔참가자 그룹 / 팔 |
개입 / 치료개입 / 치료 |
|---|---|
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실험적: 대조군(가임 정액 기증자)
가임 남성(IVI Murcia 클리닉에 참석하는 기증자)의 정자가 이 팔에 포함될 것입니다.
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정자는 여포액(FF)의 존재 여부에 따라 능력을 발휘합니다. 첫 번째 실험 세트에서 FF는 L-아르기닌과 NOS 억제제 L-NAME으로 보충됩니다. 실험의 또 다른 세트에서 정전 용량 매질에 대한 동일한 보충이 검사되지만 FF를 사용하지 않습니다. 정자에서 NOS 발현, 단백질 니트로실화, PKA 활성, 티로신 인산화 및 티로신 니트로화의 변화가 결정될 것입니다. |
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실험적: 환자(불임 남성)
환자의 정자(난임 남성, 즉 WHO 2010 지침에 따라 하나의 변경된 정자도 매개변수를 가진 남성)가 이 부문에 포함됩니다.
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정자는 여포액(FF)의 존재 여부에 따라 능력을 발휘합니다. 첫 번째 실험 세트에서 FF는 L-아르기닌과 NOS 억제제 L-NAME으로 보충됩니다. 실험의 또 다른 세트에서 정전 용량 매질에 대한 동일한 보충이 검사되지만 FF를 사용하지 않습니다. 정자에서 NOS 발현, 단백질 니트로실화, PKA 활성, 티로신 인산화 및 티로신 니트로화의 변화가 결정될 것입니다. |
연구는 무엇을 측정합니까?
주요 결과 측정
주요 결과 측정
결과 측정 |
측정값 설명 |
기간 |
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난포액의 산화질소 수치
기간: 난포액 샘플을 사용할 수 있게 된 후 30분 이내에 산화질소 수치를 측정합니다.
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수집 시 및 난모세포 제거 후 난포액 샘플을 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
분취량은 단백질을 제거하기 위해 10kDa 필터가 있는 튜브에서 추가로 원심분리됩니다.
그런 다음 이 알리쿼트는 상업적으로 이용 가능한 측정 시스템의 도움으로 NO 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
NO는 2개의 안정한 이온, 즉 아질산염과 질산염으로 빠르게 산화되며 이온 선택 전극을 사용하여 분석할 수 있습니다.
그런 다음 소프트웨어를 사용하여 산화질소의 초기 농도(마이크로몰)를 계산합니다.
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난포액 샘플을 사용할 수 있게 된 후 30분 이내에 산화질소 수치를 측정합니다.
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공동 작업자 및 조사자
협력자
협력자
수사관
수사관
- 연구 책임자: Carmen Matas Parra, Professor, University of Murcia (Spain)
- 연구 책임자: Juan Carlos Martinez Soto, MD, PhD, IVI Murcia (Spain)
- 연구 책임자: Jorge Chavarro, MD, PhD, Harvard University
- 수석 연구원: Florentin-Daniel Staicu, MSc, University of Murcia (Spain)
간행물 및 유용한 링크
일반 간행물
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