Typpioksidin (NO) suhde follikulaarisessa nesteessä ja siittiöiden hedelmöityskyvystä

Päätavoite:

Määritä muutokset NOS:n ilmentymisessä ja proteiinin nitrosylaatiossa hedelmällisillä ja hedelmättömillä potilailla, kun lisäät L-arginiinia, NO-synteesin substraattia, siittiöiden kapasitaatioväliaineeseen ihmisen follikulaarisen nesteen (hFF) läsnä ollessa/poissa ollessa.

Toissijaiset tavoitteet:

1. Tutki, liittyvätkö hFF:n vaikutukset siittiöiden kapasitaatioon nesteen NO-tasoihin.

2. Tunnista hFF:n NO-tasojen ja ART:iden kliinisten tulosten välinen korrelaatio.

   METODOLOGIA

   A. Väestö Tutkimukseen sisältyvä väestö koostuu sekä siemennesteen luovuttajista että pariskunnista, jotka käyvät IVI Murcia -klinikalla avusteisen lisääntymisen hoidossa koeputkihedelmöitystekniikoilla.

   B. Sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit Tavoitteista riippuen sekä väestömäärä että sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerit voivat vaihdella.

   Sisällyttämiskriteerit Päätavoite

   Tutkia muutoksia NOS:n ilmentymisessä sekä proteiinin nitrosylaatiossa hedelmällisillä ja subfertiilillä potilailla. Tätä tarkoitusta varten rekrytoidaan seuraavat ryhmät:

   • ryhmä hedelmällisiä miehiä, kuten IVI Murcian klinikalla käyvät siemennesteen luovuttajat;
   • ryhmä subfertiilejä miehiä, jotka koostuvat potilaista, jotka käyvät IVI Murcia -klinikalla koeputkihedelmöityshoidossa ja joilla on yksi muuttunut spermiogrammiparametri WHO:n (2010) ohjeiden mukaan.

   Toissijaisten tavoitteiden saavuttamiseksi mukaan otetaan pariskunnat, jotka käyvät läpi IVF- tai ICSI-hoidon.

   Poissulkemiskriteerit Suljetaan pois pariskunnat, joille tehdään preimplantaatiogeenidiagnoosi, joilla on diagnosoitu toistuva abortti (kolme tai useampi peräkkäinen abortti ennen viikkoa 20) tai implantaation epäonnistuminen (raskauden puute kolmen alkionsiirron jälkeen laadukkailla alkioilla alle 36-vuotiailla naisilla tai kahden alkionsiirron jälkeen yli 36-vuotiailla naisilla) sekä yli 40-vuotiailla naisilla.

   C. Näytteen koko:

   Koska NOS-ilmentymisen viitearvoja ei ole saatavilla ja koska progressiivisten siittiöiden jakautumisen vaihtelu on suuri, on määritetty, että kahdenvälisessä testissä havaitaan 20 %:n ero keskiarvoon, jonka merkitsevyystaso on 5 % ja 80 % tilastollisesta tehosta, tarvitaan 41 siemennäytettä ryhmää kohden. Siemennäytteiden määrän arvioidaan saavuttavan 24 kuukauden ajanjaksolla.

   D. Kokeen suunnittelu ja interventiot Biolääketieteellinen tutkimus, jossa on kontrolliryhmä (hedelmälliset siemennesteen luovuttajat) ja koeryhmä (subfertiilit miehet)

   Interventiot:

   Siemennestenäytteet: otetaan masturboimalla 2–7 päivän seksuaalisen pidättymisen jälkeen. Kaikki näytteet analysoidaan WHO:n ohjeiden (2010) mukaisesti. Tutkimukseen osallistuneiden miesten tarpeettomien käyntien välttämiseksi siemennestenäyte pyydetään yhdellä heidän klinikalla käynnistään.

   Siittiöt kapasitoidaan hFF:n läsnä ollessa ja ilman sitä. Ensimmäisessä koesarjassa hFF:ää täydennetään L-arginiinilla ja NOS-inhibiittorilla L-NAME. Toisessa koesarjassa tutkitaan samoja lisäyksiä kapasitaatioväliaineeseen, mutta ilman hFF:ää.

   Useita tekniikoita, kuten Western blot, in situ nitrosylation ja Biotin Switch Assay, käytetään määrittämään kaikki muutokset NOS:n ilmentymisessä ja proteiinin nitrosylaatiossa siittiöissä. Western blot -tekniikkaa sovelletaan myös muiden kapasitaatiomarkkerien, kuten proteiinikinaasi A (PKA) -aktiivisuuden, tyrosiinin fosforylaation ja tyrosiininitraamisen, arvioimiseen. Kaikille siemennesinäytteille tehdään sama käsittely riippumatta siitä, ovatko ne potilailta vai siemennesteen luovuttajilta. NÄITÄ SIEMENNÄYTTEITÄ EI KÄYTTÄÄ MISSÄÄN TAPAUKSESSA Avustetun lisääntymiskäsittelyn suorittamiseen.

   Ihmisen follikulaariset nestenäytteet:

   Follikulaarisen nesteen NO-konsentraation ja avusteisen lisääntymishoidon onnistumisen välisen korrelaation tutkimiseksi follikulaarinen nestenäytteet otetaan munasolun poimintamenettelyn aikana. Munasolun poistamisen jälkeen nämä nesteet poistetaan normaalisti, mutta tässä tapauksessa nesteitä sentrifugoidaan 10 minuuttia 2000 g:ssä ja säilytetään -20 °C:ssa arviointiin asti.

   NO-pitoisuus määritetään kaupallisesti saatavan mittausjärjestelmän avulla. NO hapettuu nopeasti kahdeksi stabiiliksi ioniksi, nitriitiksi ja nitraatiksi, jotka voidaan määrittää käyttämällä ioniselektiivisiä elektrodeja. Nämä elektrodit on pienennetty niin, että ne pystyvät mittaamaan näytteitä 30-40 µl:aan asti ja havaitsemisrajat alas molempien lajien alhaiselle µM alueelle.

   Western blot - ja proteiininitrosylaatiomääritykset suoritetaan Murcian yliopiston eläinfysiologian laboratoriossa (eläinlääketieteen tiedekunta).

   On huomattava, että follikulaarisen nesteen analysoinnin ainoa tavoite on tutkia avustetun lisääntymishoidon jälkeen, onko hoidon tuloksen ja NO-tasojen välillä korrelaatiota. Alkionsiirtopäätöksiä ei tehdä missään olosuhteissa follikulaarisen nesteen NO-tasojen perusteella.

   E. Biologisten näytteiden kerääminen Tässä tutkimuksessa arvioidaan siittiöitä ja follikulaarisia nestenäytteitä.

   • Näytteenoton tarkoitus Tässä tutkimuksessa kerättyjä näytteitä käytetään vain tutkimusprojektin loppuunsaattamiseen. Jokaiselle biologiselle näytteelle annetaan koodi, joka on riippumaton potilaiden NHC-koodista (kliinisen historian numero) ja jonka tietää vain tutkimusryhmä. Tohtori Juan Carlos Martínez Soto vastaa biologisten näytteiden varastoinnista ja säilyttämisestä.
   • Näytteenottomenetelmä Biologiset näytteet otetaan vasta, kun potilas on allekirjoittanut vastaavan tietoisen suostumuksen. Siemennäytteet otetaan masturboimalla 2–7 päivän seksuaalisen pidättymisen jälkeen. Tarpeettomien siirtymien välttämiseksi näytteenotto tapahtuu potilaan käynnin aikana klinikalla.

   Follikulaarinen nestenäytteet otetaan sinä päivänä, jona oosyyttipoiminta suoritetaan koeputkihedelmöityshoitoa varten, jota potilaat seuraavat. Tätä nestettä, joka tavallisesti heitetään pois, käytetään vain NO-arvojen määrittämiseen.

   Tämän follikulaarisen nesteen saaminen ei aiheuta lisäriskejä tai epämukavuutta lisääntymishoidosta aiheutuviin riskeihin verrattuna, koska munasolun keräämiseen käytetään kirurgista toimenpidettä follikulaarisen nesteen saamiseksi.

   • Näytteen tunnistamismenetelmä Siemenneste- ja follikkelinestenäytteet tunnistetaan tavalla, joka mahdollistaa osallistujien henkilöllisyyden turvaamisen.
   • Näytteiden säilytys Sekä siemenneste- että follikulaariset nestenäytteet säilytetään Andrologian laboratorion (IVI Murcia) pakastimissa -80°C:ssa jatkokäsittelyyn saakka tohtori Juan Carlos Martínez Soton valvonnassa. Murcian yliopistoon lähetetyt näytteet tallentaa tohtori Carmen Matás Parra. Sekä Murcian yliopiston että IVI-klinikan tiloihin on rajoitettu pääsy, joten näytteet ovat aina vartioituina. Tutkimuksen valmistuttua (tammikuu 2019) ylijäämät näytteet tuhotaan klinikan tavanomaisten protokollien mukaisesti.

   F. Tietokanta Näytteen analysointia koskevat tiedot (follikulaarineste- ja siemennestenäytteet) tallennetaan Excel-taulukoihin IVI Murcian tiloissa. Tiedot tutkimukseen osallistuneiden potilaiden seuranneiden avusteisten lisääntymishoitojen tuloksista saadaan IVI-hallintajärjestelmästä (SIVIS).

   G. Tutkimusmuuttujat

   Neljä muuttujaluokkaa erotetaan niiden merkityksen mukaan tutkimuksessa:

   Ensisijainen muuttuja: NO-tasot.

   Toissijaiset muuttujat: NOS:n ilmentyminen, etenevien siittiöiden määrä, raskausnopeus, biokemiallinen raskaus, raskauden evoluutio, implantaationopeus, kohdunulkoisen raskauden määrä.

   Kontrollimuuttujat: Tyrosiinin fosforylaatio (optiset tiheysyksiköt), PKA (optiset tiheysyksiköt), proteiinin nitrosylaatio (optiset tiheysyksiköt), nitraatit ja nitriitit (mikromolaariset yksiköt).

   Kuvailevat muuttujat: äidin ikä, isän ikä, miehen etiologia, naisen etiologia, BMI, tupakointitapa.

   H. Tietojen analyysi

   Kuvaava analyysi:

   Tilastollinen yhteenveto tutkimuksessa kerätyistä tiedoista. Kategoriset tiedot esitetään taajuustaulukoissa ja histogrammeissa. Jatkuvat arvot lasketaan yhteen keskiarvon, keskihajonnan ja luottamusvälin kanssa, ne esitetään kvartiilien tai tiheysten kuvaajina.

   Tietojen tutkiva analyysi mahdollistaa tietojen laadun arvioinnin ja poikkeamien havaitsemisen.

   Homogeenisuuden analyysi:

   Kuvaavien muuttujien (perustilanne ja demografinen) keskiarvoja ja osuuksia verrataan tutkimusryhmien vertailukelpoisuuden vahvistamiseksi. Kategorisissa muuttujissa käytetään S-khiin neliötestiä ja jatkuvissa muuttujissa T-testiä, jos oletetaan, että tiedot noudattavat normaalijakaumaa. Jos tiedot eivät noudata normaalijakaumaa, käytetään Mann-Whitney-testiä.

   Mikäli kuvailevia muuttujia löydetään siten, että ryhmien välillä on tilastollisia eroja, ne sisällytetään regressiomalliin, jotta voidaan hallita niiden häiriöitä tutkittavaan päärelaatioon.

   NO-ilmaisun vertailu:

   Hypoteesin vahvistamiseksi suhteiden korrelaatiosta NO-lausekkeessa käytetään Fisher-testiä.

   Jotta voidaan arvioida muiden komuuttujien vaikutusta, jotka voivat muuttaa NO:n ilmentymisen käyttäytymistä, määritellään logistinen regressiomalli.

   Mitä tulee proteiinien nitrosylaation vertailuun, käytetään Studentin t-testiä olettaen, että tiedot noudattavat normaalijakaumaa. Jos kolmogorov-Smirnof-testillä varmistettu normaaliusoletus ei täyty, käytetään ei-parametrista U-MannWhitney-testiä.

   Samalla tavalla määritellään lineaarinen regressiomalli, joka mahdollistaa muiden korreloitujen muuttujien vaikutuksen arvioinnin.

   Siemenlaadun arviointi:

   Seminaalin laadun muodostavalle muuttujajoukolle käytetään t-Student-testiä olettaen, että tiedot noudattavat normaalijakaumaa. Jos kolmogorov-Smirnof-testillä varmistettu normaaliusoletus ei täyty, käytetään ei-parametrista U-MannWhitney-testiä.

   Raskaustulosten arviointi:

   Raskaustulokset määrittävälle muuttujajoukolle käytetään Fisher-testiä.

   Työsuunnitelma:

   Koko tutkimusryhmän kehitysvaiheet ja tehtävien jakautuminen sekä tekniselle henkilökunnalle suunnitellut toimeksiannot. Ilmoita lisäksi hankkeen toteutuspaikka/keskus.

   Tutkimuksen suunnittelun ja projektin suunnittelun ovat tehneet tohtori Carmen Matás Parra ja Juan Carlos Martínez Soto.

   IVI Murcian klinikan lisääntymislääketieteen yksikön muodostava gynekologiryhmä, tohtori Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández ja Martina Trabalón, vastaa potilaiden ja siemennesteen luovuttajien mukaan ottamisesta tutkimukseen. suoraan vastuussa potilaille suoritetusta avusteisesta lisääntymishoidosta. Tällainen hoito sisältää: suoritettavan hoidon valinnan, munasarjojen stimulaation, munasolujen poimintamenettelyn munasolujen ja follikulaarisen nesteen keräämiseksi sekä alkionsiirron.

   Alkiot Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho ja Ana Isabel Sanchez vastaavat munasolujen hedelmöitysprosessista hedelmöityslaboratoriossa sekä siirrettävien alkioiden valinnasta.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra ja Juan Carlos Martínez Soto suorittavat sekä siemen- että follikulaaristen nestenäytteiden analyysin. Nämä analyysit tehdään sekä IVI Murcian klinikan tiloissa että Murcian yliopiston laboratorioissa.

   Tohtori Jorge Chavarro suorittaa epidemiologiset ja biostatistiset tutkimukset.