Relazione tra ossido nitrico (NO) nel fluido follicolare e capacità di fecondazione dello sperma

Obiettivo principale:

Determinare i cambiamenti nell'espressione di NOS e nella nitrosilazione proteica in pazienti fertili e infertili, quando si aggiunge L-arginina, il substrato per la sintesi di NO, al mezzo di capacitazione dello sperma in presenza/assenza di fluido follicolare umano (hFF).

Obiettivi secondari:

1. Indagare se gli effetti dell'hFF sulla capacità degli spermatozoi sono associati ai livelli di NO nel fluido.

2. Identificare la correlazione tra i livelli di NO in hFF e gli esiti clinici delle ART.

   METODOLOGIA

   A. Popolazione La popolazione inclusa nello studio comprenderà sia donatori di seme che coppie che frequentano la clinica IVI Murcia per un trattamento di riproduzione assistita attraverso tecniche di fecondazione in vitro.

   B. Criteri di inclusione/esclusione A seconda degli obiettivi, sia la popolazione che i criteri di inclusione ed esclusione possono variare.

   Criteri di inclusione Obiettivo principale

   Esaminare le modificazioni nell'espressione di NOS e la nitrosilazione proteica in pazienti fertili e subfertili. A tal fine verranno reclutati i seguenti gruppi:

   • un gruppo di maschi fertili, come i donatori di seme che frequentano la clinica IVI Murcia;
   • un gruppo di maschi subfertili composto da pazienti, che frequentano la clinica IVI Murcia per sottoporsi a un trattamento di fecondazione in vitro e che possiedono un parametro dello spermiogramma alterato, secondo le linee guida dell'OMS (2010).

   Per il raggiungimento degli Obiettivi Secondari saranno incluse le coppie che si sottopongono a un trattamento di fecondazione in vitro o ICSI.

   Criteri di esclusione Saranno escluse le coppie sottoposte a diagnosi genetica preimpianto, a cui è stato diagnosticato un aborto ripetuto (tre o più aborti consecutivi prima della 20a settimana) o fallimento dell'impianto (mancanza di gravidanza dopo tre trasferimenti di embrioni con embrioni di buona qualità in donne di età inferiore a 36 anni o dopo due trasferimenti di embrioni in donne di età superiore a 36 anni), nonché donne di età superiore a 40 anni.

   C. Dimensione del campione:

   Poiché i valori di riferimento per l'espressione di NOS non sono disponibili e poiché la variabilità della distribuzione degli spermatozoi progressivi è elevata, è stato stabilito che per rilevare una differenza del 20% rispetto alla media in un test bilaterale, con un livello di significatività di 5% e 80% della potenza statistica, saranno necessari 41 campioni di seme per gruppo. Si stima un periodo di 24 mesi per raggiungere il numero di campioni seminali.

   D. Disegno sperimentale e interventi Studio di ricerca biomedica con gruppo di controllo (donatori di seme fertile) e gruppo sperimentale (maschi subfertili)

   Interventi:

   Campioni di seme: saranno ottenuti mediante masturbazione dopo 2-7 giorni di astinenza sessuale. Tutti i campioni saranno analizzati secondo le linee guida dell'OMS (2010). Per evitare visite non necessarie per gli uomini inclusi nello studio, il campione di seme sarà richiesto durante una delle loro visite alla clinica.

   Gli spermatozoi saranno capacitati in presenza e in assenza di hFF. In una prima serie di esperimenti, l'hFF sarà integrato con L-Arginina e l'inibitore NOS L-NAME. In un'altra serie di esperimenti saranno esaminate le stesse integrazioni al mezzo capacitivo, ma senza l'utilizzo di hFF.

   Una serie di tecniche come Western blot, nitrosilazione in situ e Biotin Switch Assay saranno utilizzate per determinare eventuali cambiamenti nell'espressione di NOS e nella nitrosilazione proteica negli spermatozoi. La tecnica Western blot sarà applicata anche per valutare altri marcatori di capacità come l'attività della Protein Kinase A (PKA), la fosforilazione della tirosina e la nitrazione della tirosina. Lo stesso trattamento verrà eseguito su tutti i campioni di seme indipendentemente dal fatto che provengano da pazienti o da donatori di seme. IN NESSUN CASO QUESTI CAMPIONI DI SEME SARANNO UTILIZZATI PER ESEGUIRE UN TRATTAMENTO DI RIPRODUZIONE ASSISTITA.

   Campioni di fluido follicolare umano:

   Per studiare la correlazione tra la concentrazione di NO nel liquido follicolare e il successo del trattamento di riproduzione assistita, i campioni di liquido follicolare saranno prelevati durante la procedura di prelievo degli ovociti. Dopo la rimozione degli ovociti, questi fluidi vengono normalmente eliminati, ma in questo caso i fluidi saranno centrifugati per 10 minuti a 2000g e conservati a -20°C fino alla valutazione.

   La concentrazione di NO sarà determinata con l'ausilio di un sistema di misurazione disponibile in commercio. L'NO viene rapidamente ossidato in due ioni stabili, vale a dire nitrito e nitrato, che possono essere analizzati utilizzando elettrodi iono-selettivi. Questi elettrodi sono stati miniaturizzati per essere in grado di misurare campioni fino a 30-40 µl con limiti di rilevamento fino all'intervallo basso µM per entrambe le specie.

   I saggi di Western blot e di nitrosilazione proteica saranno eseguiti all'interno del laboratorio di Fisiologia Animale, presso l'Università di Murcia (Facoltà di Medicina Veterinaria).

   Va notato che l'unico obiettivo dell'analisi del liquido follicolare è quello di indagare dopo il trattamento di riproduzione assistita se esiste una correlazione tra il risultato del trattamento ei livelli di NO. In nessun caso le decisioni relative al trasferimento di embrioni saranno prese in base ai livelli di NO nel liquido follicolare.

   E. Raccolta di campioni biologici Campioni di sperma e liquido follicolare saranno valutati nel presente studio.

   • Scopo della raccolta dei campioni I campioni raccolti nel presente studio saranno utilizzati esclusivamente per il completamento del progetto di ricerca. Ad ogni campione biologico verrà assegnato un codice, che sarà indipendente dal codice NHC (numero di storia clinica) dei pazienti e sarà noto solo al gruppo di ricerca. Il Dr. Juan Carlos Martínez Soto sarà responsabile della conservazione e della custodia dei campioni biologici.
   • Modalità di raccolta dei campioni I campioni biologici verranno prelevati solo dopo che il paziente avrà firmato il relativo consenso informato. I campioni seminali saranno ottenuti mediante masturbazione dopo 2-7 giorni di astinenza sessuale. Per evitare inutili spostamenti, il prelievo del campione avverrà durante la visita del paziente in ambulatorio.

   I campioni di fluido follicolare saranno prelevati il ​​giorno della procedura di prelievo degli ovociti eseguita per il trattamento di fecondazione in vitro che le pazienti seguiranno. Questo fluido, che normalmente viene scartato, verrà utilizzato solo per determinare i valori di NO.

   L'ottenimento di questo fluido follicolare non comporta alcun rischio o disagio aggiuntivo rispetto a quelli causati dal trattamento di riproduzione, poiché per ottenere il fluido follicolare viene utilizzata la procedura chirurgica del prelievo di ovociti.

   • Metodo per l'identificazione del campione I campioni di liquido seminale e follicolare saranno identificati in un modo che consentirà di salvaguardare l'identità dei partecipanti.
   • Conservazione dei campioni Sia i campioni di liquido seminale che follicolare saranno conservati in congelatori nel laboratorio di Andrologia (IVI Murcia) a -80°C fino al successivo trattamento, sotto la supervisione del Dott. Juan Carlos Martínez Soto. I campioni inviati all'Università di Murcia saranno conservati dalla dott.ssa Carmen Matás Parra. Sia le strutture dell'Università di Murcia che quelle della clinica IVI hanno un accesso limitato, pertanto i campioni saranno sempre custoditi. Al termine dello studio (gennaio 2019), i campioni in eccesso verranno distrutti seguendo i consueti protocolli della clinica.

   F. Database I dati relativi all'analisi dei campioni (campioni di liquido follicolare e seme), saranno archiviati in tabelle Excel nelle strutture dell'IVI Murcia. I dati relativi ai risultati dei trattamenti di riproduzione assistita che sono stati seguiti dai pazienti inclusi nello studio saranno ottenuti dal sistema di gestione IVI (SIVIS).

   G. Variabili di studio

   Si distingueranno quattro classi di variabili in base alla loro rilevanza all'interno dello studio:

   Variabile primaria: NO livelli.

   Variabili secondarie: espressione di NOS, tasso di spermatozoi progressivi, tasso di gravidanza, gravidanza biochimica, evoluzione della gravidanza, tasso di impianto, tasso di gravidanza ectopica.

   Variabili di controllo: fosforilazione della tirosina (unità di densità ottica), PKA (unità di densità ottica), nitrosilazione proteica (unità di densità ottica), nitrati e nitriti (unità micromolari).

   Variabili descrittive: età materna, età paterna, eziologia maschile, eziologia femminile, BMI, abitudine al fumo.

   H. Analisi dei dati

   Analisi descrittiva:

   Sintesi statistica dei dati raccolti nello studio. I dati categorici saranno presentati in tabelle di frequenza e istogrammi. I valori continui saranno riassunti con la media, la deviazione standard e l'intervallo di confidenza, saranno rappresentati da grafici di quartili o densità.

   L'analisi esplorativa dei dati consentirà di valutare la qualità dei dati e l'individuazione di anomalie.

   Analisi di omogeneità:

   Le medie e le proporzioni delle variabili descrittive (di base e demografiche) saranno confrontate per convalidare il grado di comparabilità dei gruppi di studio. Verrà applicato il test S chi-quadrato nelle variabili categoriali e, assumendo che i dati seguano una distribuzione normale, un test T nelle variabili continue. Se i dati non seguono una distribuzione normale, verrà applicato un test di Mann-Whitney.

   Nel caso di trovare variabili descrittive distribuite in modo che vi siano differenze statistiche tra i gruppi, esse saranno incluse in un modello di regressione, per controllare la loro interferenza nella relazione principale da studiare.

   Confronto dell'espressione NO:

   Per convalidare un'ipotesi di correlazione di proporzioni nell'espressione di NO, verrà applicato un test di Fisher.

   Per valutare l'effetto di altre covariabili che possono modificare il comportamento dell'espressione NO, verrà definito un modello di regressione logistica.

   Per quanto riguarda il confronto della nitrosilazione proteica, verrà applicato un test t di Student assumendo che i dati seguano una distribuzione normale. Se l'ipotesi di normalità non sarà soddisfatta, verificata da un test di Kolmogorov-Smirnof, verrà applicato un test U-MannWhitney non parametrico.

   Allo stesso modo verrà definito un modello di regressione lineare che consenta di valutare l'effetto di altre variabili correlate.

   Valutazione della qualità seminale:

   Per l'insieme delle variabili che compongono la qualità seminale verrà applicato un test t-Student ipotizzando che i dati seguano una distribuzione normale. Se l'ipotesi di normalità non sarà soddisfatta, verificata da un test di Kolmogorov-Smirnof, verrà applicato un test U-MannWhitney non parametrico.

   Valutazione degli esiti gestazionali:

   Per l'insieme delle variabili che definiscono i risultati della gestazione verrà applicato un test di Fisher.

   Piano di lavoro:

   Fasi di sviluppo e distribuzione dei compiti dell'intero gruppo di ricerca e degli incarichi previsti per il personale tecnico. Indicare inoltre luogo/centro di realizzazione del progetto.

   Il disegno dello studio, così come la stesura del progetto sono stati curati dai Dottori Carmen Matás Parra e Juan Carlos Martínez Soto.

   Il team di ginecologi che compongono l'Unità di Medicina della Riproduzione presso la clinica IVI Murcia, Dr. Jose Landeras, María Nicolás, Laura Fernández e Martina Trabalón, sarà responsabile dell'inclusione dei pazienti e dei donatori di seme nello studio, così come il diretto responsabile del trattamento di riproduzione assistita eseguito sulle pazienti. Tale trattamento include: la scelta del trattamento da eseguire, la stimolazione ovarica, la procedura di raccolta degli ovociti per raccogliere gli ovociti e il fluido follicolare, nonché il trasferimento dell'embrione.

   Gli embriologi Marta Molla, David Gumbao, Julián Marcos, Beatriz Amorocho e Ana Isabel Sanchez saranno responsabili del processo di fecondazione degli ovociti nel laboratorio di fecondazione, nonché della selezione degli embrioni da trasferire.

   Florentin-Daniel Staicu, Carmen Matás Parra e Juan Carlos Martínez Soto eseguiranno l'analisi di campioni di liquido seminale e follicolare. Queste analisi saranno effettuate sia nelle strutture della clinica IVI Murcia che nei laboratori dell'Università di Murcia.

   Il dottor Jorge Chavarro condurrà gli studi epidemiologici e biostatistici.