프로테오믹스 분석으로 장기 이식 기능 부전에서 선천 면역 활성 발견

서론:

장이식(ITx)은 생명을 위협하는 합병증이 발생한 장기능 부전 환자에게 생존 가능한 수단을 제공합니다. 전 세계적으로 매년 약 200건의 장이식 시술이 이루어지며, 총 2200건의 시술이 수행되었는데, 이 중 3분의 2는 소아에서 이루어졌습니다. 전반적으로, 수술 기술, 면역억제 및 이식 후 관리의 혁신으로 지난 몇 년간 환자 및 이식편 생존율이 크게 향상되었습니다. 경험이 많은 센터에서는 1년 환자 생존율이 80-90%에 근접합니다. 그럼에도 불구하고, 급성 세포성 거부반응(ACR)은 여전히 이러한 환자들에게 주요 도전 과제로 남아 있습니다.

현재, ACR 진단의 금표준은 내시경 검사 시 채취한 생검 샘플의 조직학적 검사입니다. 한계점으로는 내시경 검사가 정의상 침습적이며, 비용이 많이 들고, 출혈, 감염, 천공의 위험이 있으며, 잠재적으로 부정확할 수 있다는 사실이 포함됩니다. ACR은 부분적으로 나타나는 과정으로 나타날 수 있어, 최대 30%의 경우 내시경 감시에서 놓칠 수 있습니다. 또한 감염과 유사한 양상으로 나타나 환자의 최적 관리에 대한 진단적 딜레마를 초래합니다. 장이식 수혜자의 진단 및 관리에서 이러한 지연과 부정확성은 환자 및 이식편 손실로 이어질 가능성이 있습니다. 장이식 분야를 지속적으로 발전시키기 위해서는 ACR을 모니터링하기 위한 새로운 비침습적 기술이 분명히 필요합니다.

프로테오믹스는 가능한 바이오마커로서의 단백질 식별을 가능하게 합니다. 단백질 프로파일은 체액에서 쉽게 검출될 수 있어, 이러한 단백질 조합은 진단 또는 질병 모니터링에 유용한 혁신적인 바이오마커가 될 수 있습니다. 단백질 및 대사체 수준을 추적하는 것은 ACR이 의심되는 환자에게 정확한 선별 도구가 될 수 있습니다.

본 연구에서는 고처리량 프로테오믹 분석 및 장루 배액물의 후보 면역분석 단백질 검출을 사용하여 ACR 동안 상피 스트레스 및 선천성 면역의 분자 프로파일을 비침습적으로 탐색합니다.

면역억제:

모든 환자는 타크로리무스 기반의 삼제 면역억제 요법으로 관리됩니다. 표준 면역억제 요법에는 인터루킨-2 수용체 길항제(다클리주맙 또는 바실릭시맙) 또는 토끼 항흉선세포 글로불린을 이용한 유도 요법이 포함됩니다. 유지 요법은 타크로리무스, 코르티코스테로이드 및 미코페놀레이트 모페틸로 구성됩니다. 목표 타크로리무스 골지 수치는 10-15 ng/mL입니다. 시롤리무스는 구제 요법 및 신장 보호 요법의 일부로 사용됩니다. ACR은 조직병리학으로 진단되며 고용량 스테로이드로 치료됩니다. 심한 ACR 환자에서는 ATG가 구제 요법으로 사용됩니다. 고도로 감작된 환자 또는 항체 매개 거부반응이 의심되는 환자에서는 혈장분리술, 리툭시맙 및 정맥내 면역글로불린의 병합 요법이 사용됩니다.

장 감시:

이식된 장의 프로토콜 생검은 수술 후 7-14일부터 시작하여 처음 3-4주 동안 주 1회, 이후 장이식 후 8주까지 2주마다 1회 수행됩니다. 내시경 및 생검은 또한 이식편 기능 이상을 나타내는 임상 증상이 있을 때 수행됩니다. 다수의 표적 생검이 채취되며, 파라핀 포매 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색한 후, UCLA 소화기 병리학자 3인 중 1인이 표준 거부반응 기준에 따라 ACR 등급을 평가합니다. 이상 소견이 발견되면 지시에 따라 추가 내시경 감시가 이루어집니다.

장루 배액물 수집 및 프로테오믹 평가:</p

장루 배액물을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓고, UCLA 고처리량 임상 프로테오믹스 질량 분석 핵심 실험실에서 일괄 처리합니다. 모든 샘플은 MALDI 질량 분석을 사용하여 삼중으로 처리 및 분석됩니다. MALDI-MS 스펙트럼은 텍스트 파일로 변환되고, 확립된 프로토콜을 사용하여 전처리됩니다. 전처리된 MALDI 데이터는 SpecAlign에서 내보내고 R에서 추가 분석됩니다.

효소 결합 면역흡착 분석 및 면역조직화학:

인간 HNP 1-3은 제조사 지침(Cell Sciences, Canton, MA)에 따라 ELISA 키트를 사용하여 처리된 단백질 샘플에서 이중으로 정량 분석되며, 각 플레이트에 대해 구성된 HNP1-3 표준 곡선을 사용합니다. 각 테스트 샘플에 대한 단백질 농도도 측정되며(BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), HNP1-3 수준은 총 단백질에 대해 정규화됩니다(pg/mg).

면역조직화학의 경우, 생검 절편을 탈파라핀 처리하고, 표준 방법으로 배경 과산화효소 활성 및 염소 항체 결합을 차단한 후, 인간 항-HNP 1-3 항체(토끼, 1:2000) 또는 음성 대조군으로 사전 면역 혈청(토끼, 1:2000)으로 염색합니다. 절편은 제조사 프로토콜에 따라 Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories)의 항-토끼 IgG 생물소화 이차 항체 및 스트렙타비딘-과산화효소 접합 삼차 항체로 추가 배양하고, 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 기질 용액(Pierce, Rockford, IL)으로 발색합니다. 면역조직화학 정량 분석을 위해, 생검 슬라이드의 세 가지 다른 영역에서 10개의 장선와를 평가하여 유의한 디펜신 염색 증거를 확인합니다. 디펜신 양성 장선와의 수를 세고 평균을 냅니다.

루민넥스:

처리된 장루 배액물의 일부를 루민넥스 평가에 사용하며, Bio-Rad 인간 사이토카인 17-플렉스 분석을 제조사 지침(Bio-Rad, Hercules, CA)에 따라 수행합니다. 데이터는 Bio-Plex 200 시스템에서 획득하고 관련 소프트웨어(Bio-Rad)로 분석하며, 사이토카인 농도는 단백질 농도에 대해 정규화되고 로그 변환됩니다.