プロテオミクス解析により腸管移植不全における自然免疫活性が明らかに

はじめに：

腸移植（ITx）は、生命を脅かす合併症を発症した腸不全患者にとって生存の可能性を提供します。 世界では年間約200件のITx手術が行われており、合計で2200件が実施されており、そのうち3分の2は小児を対象としています。 過去数年間で、手術技術、免疫抑制療法、移植後管理の革新により、患者および移植片の生存率は大幅に改善されました。 経験豊富な施設では、1年後の患者生存率は80〜90％に達しています。 それにもかかわらず、急性細胞性拒絶反応（ACR）はこれらの患者において依然として大きな課題となっています。

現在、ACRを診断するためのゴールドスタンダードは、内視鏡検査時に採取された生検サンプルの組織学的検査です。 限界としては、内視鏡検査は定義上侵襲的であり、費用がかかり、出血、感染、穿孔のリスクが伴い、不正確である可能性があるという事実が挙げられます。 ACRは斑状のプロセスとして現れることがあり、内視鏡による監視では最大30％の確率で見逃される可能性があります。 また、感染と同様の様相を呈するため、患者の最適な管理に関する診断上のジレンマを引き起こします。 ITx受容者における診断と管理の遅れや不正確さは、患者および移植片の喪失につながる可能性があります。 ACRを監視するための新しい非侵襲的技術は、ITxの分野を前進させ続けるために明らかに必要とされています。

プロテオミクスにより、タンパク質を可能なバイオマーカーとして同定することができます。 タンパク質プロファイルは体液中で容易に検出できるため、これらのタンパク質の組み合わせは、診断や疾患モニタリングに有用な革新的なバイオマーカーとなる可能性があります。 タンパク質および代謝物レベルの追跡は、ACRが疑われる患者の正確なスクリーニングツールとなる可能性があります。

本研究では、高スループットプロテオミクス分析および候補免疫測定タンパク質検出をストーマ排出液に適用し、非侵襲的な方法でACR中の上皮ストレスおよび自然免疫の分子プロファイルを探索します。

免疫抑制療法：

すべての患者はタクロリムスを基盤とする三重免疫抑制療法で管理されます。 標準的な免疫抑制レジメンには、ダクリズマブまたはバシリキシマブなどのインターロイキン-2受容体拮抗薬、またはウサギ抗胸腺細胞グロブリンによる導入療法が含まれます。 維持療法は、タクロリムス、コルチコステロイド、およびミコフェノール酸モフェチルで構成されます。 目標タクロリムストラフレベルは10〜15 ng/mLです。 シロリムスはレスキュー剤として、および腎臓温存レジメンの一部として使用されます。 ACRは組織病理学により診断され、高用量ステロイドで治療されます。 重度のACR患者では、ATGがレスキュー剤として使用されます。 高度に感作された患者または抗体媒介性拒絶反応が疑われる患者では、血漿交換、リツキシマブ、およびIVIGの併用療法が使用されます。

腸管サーベイランス：

移植腸のプロトコール生検は、術後7〜14日目から週1回、最初の3〜4週間実施され、その後ITx後8週間まで2週間ごとに1回実施されます。 内視鏡検査および生検は、異常な同種移植片機能を示す臨床症状がある場合にも実施されます。 複数の標的生検が採取され、パラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色し、UCLAの3人の消化器病理医の1人により標準的な拒絶反応基準を用いてACRのグレード評価が行われます。 異常な結果は、適宜さらなる内視鏡サーベイランスを促します。

ストーマ排出液の収集およびプロテオミクス評価：

ストーマ排出液は収集され、直ちに氷上に置かれ、UCLA高スループット臨床プロテオミクス質量分析コアラボラトリーでバッチ処理されます。 すべてのサンプルは、MALDI質量分析を用いて三重複で処理および分析されます。 MALDI-MSスペクトルはテキストファイルに変換され、確立されたプロトコルを用いて前処理されます。 前処理されたMALDIデータはSpecAlignからエクスポートされ、Rでさらに分析されます。

酵素結合免疫吸着測定法および免疫組織化学：

ヒトHNP 1-3は、製造元の指示に従い（Cell Sciences、Canton、MA）、各プレート用に作成されたHNP1-3標準曲線を使用して、ELISAキットにより二重に処理されたタンパク質サンプルで定量されます。 また、各試験サンプルのタンパク質濃度も決定され（BCA、Pierce Thermo Scientific、Rockford、IL）、HNP1-3レベルは総タンパク質（pg/mg）に対して正規化されます。

免疫組織化学では、生検切片を脱パラフィン化し、標準的な方法でバックグラウンドペルオキシダーゼ活性およびヤギ抗体結合をブロックし、ヒト抗HNP 1-3抗体（ウサギ、1：2000）または陰性対照として前免疫血清（ウサギ、1：2000）で染色します。 切片はさらに、製造元のプロトコルに従い、抗ウサギIgGビオチン化二次抗体およびストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ共役三次抗体（Vectastain Elite ABCキット、Vector Laboratories）でインキュベーションし、ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）基質溶液（Pierce、Rockford、IL）で発色させます。 免疫組織化学定量では、生検スライド上の3つの異なる視野で10個の陰窩を評価し、有意なデフェンシン染色の証拠を調べます。 デフェンシン陽性陰窩の数がカウントされ、平均化されます。

ルミネックス：

処理されたストーマ排出液の一部をルミネックス評価に使用し、製造元の指示に従い（Bio-Rad、Hercules、CA）、Bio-Radヒトサイトカイン17プレックスアッセイを実施します。 データはBio-Plex 200システムで取得され、関連ソフトウェア（Bio-Rad）で分析され、サイトカイン濃度はタンパク質濃度に対して正規化され、対数変換されます。