Análisis Proteómico Revela Actividad Inmune Innata en la Disfunción del Trasplante Intestinal

INTRODUCCIÓN:

El trasplante intestinal (TI) ofrece un medio potencial de supervivencia para pacientes con insuficiencia intestinal que han desarrollado complicaciones potencialmente mortales. Aproximadamente 200 procedimientos de TI se realizan en todo el mundo cada año, habiéndose realizado 2200 de estos procedimientos en total, dos tercios de los cuales han sido en niños. En general, las tasas de supervivencia del paciente y del injerto han mejorado significativamente en los últimos años debido a innovaciones en técnicas quirúrgicas, inmunosupresión y manejo postrasplante. Las tasas de supervivencia del paciente a un año se acercan al 80-90% en centros experimentados. No obstante, el rechazo celular agudo (RCA) sigue planteando grandes desafíos en estos pacientes.

Actualmente, el estándar de oro para diagnosticar el RCA es el examen histológico de muestras de biopsia obtenidas en el momento de la endoscopia. Las limitaciones incluyen el hecho de que la endoscopia es por definición invasiva, costosa, asociada con riesgos de sangrado, infección o perforación, y potencialmente inexacta. El RCA puede presentarse como un proceso irregular que puede pasar desapercibido en la vigilancia endoscópica hasta el 30% de las veces. También se presenta de manera similar a una infección, lo que conduce a un dilema diagnóstico en cuanto al manejo óptimo del paciente. Tales retrasos e inexactitudes en el diagnóstico y manejo de los receptores de TI tienen el potencial de conducir a la pérdida del paciente y del injerto. Claramente se necesitan nuevas técnicas no invasivas para monitorizar el RCA para continuar impulsando el campo del TI.

La proteómica permite la identificación de proteínas como posibles biomarcadores. Los perfiles proteicos pueden detectarse fácilmente en fluidos corporales, lo que hace que estas combinaciones de proteínas sean biomarcadores innovadores potencialmente útiles en el diagnóstico o monitoreo de enfermedades. El seguimiento de los niveles de proteínas y metabolitos puede resultar una herramienta de cribado precisa para pacientes con sospecha de RCA.

En este estudio, utilizamos análisis proteómico de alto rendimiento y detección proteica por inmunoensayo candidato de efluentes de ostomía para buscar de manera no invasiva perfiles moleculares de estrés epitelial e inmunidad innata durante el RCA.

INMUNOSUPRESIÓN:

Todos los pacientes son manejados con inmunosupresión triple basada en tacrolimus. Nuestro régimen estándar de inmunosupresión incluye inducción con un antagonista del receptor de interleucina-2 como daclizumab o basiliximab, versus globulina antitimocítica de conejo. La terapia de mantenimiento consiste en tacrolimus, corticosteroides y micofenolato mofetilo. Los niveles objetivo de valle de tacrolimus son de 10-15 ng/mL. El sirolimus se utiliza como agente de rescate y como parte de un régimen de ahorro renal. El RCA se diagnostica por histopatología y se trata con esteroides en dosis altas. En pacientes con RCA grave, se utiliza ATG como agente de rescate. En pacientes altamente sensibilizados o pacientes con sospecha de rechazo mediado por anticuerpos, se utiliza una combinación de plasmaféresis, Rituximab e IVIG.

VIGILANCIA INTESTINAL:

Se obtienen biopsias de protocolo del intestino trasplantado una vez por semana comenzando entre los días 7 y 14 postoperatorios durante las primeras 3-4 semanas, luego una vez cada 2 semanas hasta las 8 semanas después del TI. También se obtienen endoscopia y biopsias por síntomas clínicos que indican función anormal del aloinjerto. Se obtienen múltiples biopsias dirigidas, y las secciones incluidas en parafina teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) son clasificadas para RCA usando criterios estándar de rechazo por uno de los tres patólogos gastrointestinales de UCLA. Los resultados anormales impulsan una mayor vigilancia endoscópica según se indique.

RECOLECCIÓN DE EFLUENTE DE OSTOMÍA Y EVALUACIÓN PROTEÓMICA:

Los efluentes de ostomía se recolectan, se colocan inmediatamente en hielo y se procesan por lotes en el laboratorio central de espectrometría de masas de Proteómica Clínica de Alto Rendimiento de UCLA. Todas las muestras se procesan y analizan por triplicado usando espectrometría de masas MALDI. Los espectros MALDI-MS se convierten a archivos de texto y se preprocesan usando un protocolo establecido. Los datos MALDI preprocesados se exportan luego de SpecAlign y se analizan más a fondo en R.

ENSAYO POR INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS E INMUNOHISTOQUÍMICA:

La HNP 1-3 humana se cuantifica por duplicado en muestras de proteína procesadas mediante un kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Cell Sciences, Canton, MA), usando una curva estándar de HNP1-3 construida para cada placa. También se determinan las concentraciones de proteína para cada muestra de prueba (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), y los niveles de HNP1-3 se normalizan a la proteína total (pg/mg).

Para IHQ, las secciones de biopsia se desparafinizan, se bloquea la actividad de peroxidasa de fondo y la unión de anticuerpo de cabra mediante métodos estándar, y se tiñen con anticuerpo anti-HNP 1-3 humano (conejo, 1:2000) o suero preinmunizado (conejo, 1:2000) como control negativo. Las secciones se incuban adicionalmente con un anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG de conejo y un anticuerpo terciario conjugado con estreptavidina-peroxidasa del kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) según el protocolo del fabricante, y se desarrollan mediante solución sustrato de diaminobencidina tetrahidrocloruro (DAB) (Pierce, Rockford, IL). Para la cuantificación de IHQ, se evalúan 10 criptas en tres campos diferentes en la diapositiva de biopsia en busca de evidencia de tinción significativa de defensina. Se cuenta y promedia el número de criptas positivas para defensina.

LUMINEX:

Se utiliza una alícuota de efluente de ostomía procesado para evaluación Luminex, con el ensayo Bio-Rad de citoquinas humanas 17-plex según las instrucciones del fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA). Los datos se adquieren en un sistema Bio-Plex 200 y se analizan con el software asociado (Bio-Rad), y las concentraciones de citoquinas se normalizan a la concentración de proteína y se transforman logarítmicamente.