Proteomisk analyse avdekker medfødt immunaktivitet ved dysfunksjon av tarmtransplantat

INNLEDNING:

Intestinal transplantasjon (ITx) tilbyr en potensiell overlevelsesmulighet for pasienter med tarminsuffisiens som har utviklet livstruende komplikasjoner. Omtrent 200 ITx-prosedyrer utføres årlig på verdensbasis, med totalt 2200 slike prosedyrer utført, hvorav to tredjedeler har vært på barn. Generelt har pasient- og graftoverlevelsessatser forbedret seg betydelig de siste årene på grunn av innovasjoner innen kirurgiske teknikker, immunsuppresjon og post-transplantasjonshåndtering. Ett års pasientoverlevelse nærmer seg 80-90 % på erfarne sentre. Likevel fortsetter akutt cellulær avstøting (ACR) å utgjøre store utfordringer for disse pasientene.

For tiden er den gyldne standarden for å diagnostisere ACR histologisk undersøkelse av biopsiprøver tatt under endoskopi. Begrensninger inkluderer at endoskopi per definisjon er invasivt, kostbart, forbundet med risiko for blødning, infeksjon eller perforasjon, og potensielt unøyaktig. ACR kan presentere seg som en flekkvis prosess som kan bli oversett av endoskopisk overvåkning opptil 30 % av tiden. Det presenterer seg også på lignende måte som infeksjon, noe som fører til et diagnostisk dilemma angående optimal behandling av pasienten. Slike forsinkelser og unøyaktigheter i diagnostiseringen og behandlingen av ITx-mottakere har potensiale til å føre til tap av pasient og graft. Nye ikke-invasive teknikker for å overvåke ACR er tydeligvis nødvendige for å fortsette å drive ITx-feltet fremover.

Proteomikk muliggjør identifisering av proteiner som mulige biomarkører. Proteinprofiler kan enkelt oppdages i kroppsvæsker, noe som gjør disse proteinkombinasjonene potensielt innovative biomarkører nyttige i diagnostikk eller sykdomsmonitorering. Overvåkning av protein- og metabolittnivåer kan vise seg å være et nøyaktig screeningverktøy for pasienter mistenkt for å ha ACR.

I denne studien bruker vi høyt gjennomstrømningsproteomisk analyse og kandidat-immunoassay-proteindeteksjon av stomiaffluent for å søke på en ikke-invasiv måte etter molekylære profiler av epitelstress og medfødt immunitet under ACR.

IMMUNSUPPRESJON:

Alle pasienter behandles med tacrolimus-basert trippel immunsuppresjon. Vår standard immunsuppresjonsregime inkluderer induksjon med en interleukin-2-reseptorantagonist som daclizumab eller basiliximab, kontra kanin antitymocytglobulin. Vedlikeholdsterapi består av tacrolimus, kortikosteroider og mycophenolat mofetil. Mål-tacrolimus-trough-nivåer er 10-15 ng/mL. Sirolimus brukes som en redningsmiddel og som en del av en nyresparingsregime. ACR diagnostiseres av histopatologi og behandles med høydose steroider. Hos pasienter med alvorlig ACR brukes ATG som redningsmiddel. Hos høyt sensitiverte pasienter eller pasienter mistenkt for antistoff-mediert avstøting, brukes en kombinasjon av plasmaferese, Rituximab og IVIG.

TARMOVERVÅKNING:

Protokollbiopsier av den transplanterte tarmen tas en gang i uken fra postoperativ dag 7-14 de første 3-4 ukene, deretter en gang hver andre uke til 8 uker etter ITx. Endoskopi og biopsier tas også for kliniske symptomer som indikerer abnorm allograftfunksjon. Flere målrettede biopsier tas, og parafinn-innbåtte snitt farget med hematoksylin og eosin (H&E) graderes for ACR ved bruk av standard avstøtningskriterier av en av tre UCLA gastrointestinale patologer. Unormale resultater utløser videre endoskopisk overvåkning som angitt.

STOMIAFFLUENTINNSAMLING OG PROTEOMISK EVALUERING:

Stomiaffluenter samles, umiddelbart plassert på is, og batch-behandlet ved UCLA High Throughput Clinical Proteomics massespektrometrikjerne laboratorium. Alle prøver behandles og analyseres i triplikat ved bruk av MALDI massespektrometri. MALDI-MS-spektra konverteres til tekstfiler og forbehandles ved hjelp av en etablert protokoll. De forbehandlede MALDI-dataene eksporteres deretter fra SpecAlign og analyseres videre i R.

ENZYMLENKET IMMUNOSORBENTASSAY OG IMMUNOHISTOKJEMI:

Humant HNP 1-3 kvantifiseres i duplikat behandlede proteinprøver med en ELISA-kit i henhold til produsentens instruksjoner (Cell Sciences, Canton, MA), ved hjelp av en HNP1-3 standardkurve konstruert for hver plate. Proteinkonsentrasjoner bestemmes også for hver testprøve (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), og HNP1-3-nivåer normaliseres til totalt protein (pg/mg).

For IHC deparaffineres biopsiseksjoner, blokkeres for bakgrunnsperoksidaseaktivitet og geiteantistoffbinding ved standardmetoder, og farges med humant anti-HNP 1-3-antistoff (kanin, 1:2000) eller pre-immunisert serum (kanin, 1:2000) som negativ kontroll. Seksjonene inkuberes videre med et anti-Kanin IgG biotinylert sekundærantistoff og streptavidin-peroksidase konjugert tertiærantistoff fra Vectastain Elite ABC-kit (Vector Laboratories) i henhold til produsentens protokoll, og utvikles med diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) substratløsning (Pierce, Rockford, IL). For IHC-kvantifisering evalueres 10 kryptor i tre forskjellige felt på biopsigliden for bevis på signifikant defensinfarging. Antall defensinpositive kryptor telles og gjennomsnittsberegnes.

LUMINEX:

En alikvot av behandlet stomiaffluent brukes til Luminex-evaluering, med Bio-Rad human cytokin 17-plex assay i henhold til produsentens instruksjoner (Bio-Rad, Hercules, CA). Data innhentes på et Bio-Plex 200-system og analyseres med tilhørende programvare (Bio-Rad), og cytokinkonsentrasjoner normaliseres til proteinkonsentrasjon og log-transformeres.