Proteomanalyse zeigt angeborene Immunaktivität bei Darmtransplantat-Dysfunktion

EINLEITUNG:

Die Darmtransplantation (ITx) bietet eine potenzielle Überlebenschance für Patienten mit Darmversagen, die lebensbedrohliche Komplikationen entwickelt haben. Weltweit werden jährlich etwa 200 ITx-Eingriffe durchgeführt, wobei insgesamt 2200 solcher Verfahren durchgeführt wurden, zwei Drittel davon bei Kindern. Insgesamt haben sich die Überlebensraten von Patienten und Transplantaten in den letzten Jahren aufgrund von Innovationen in chirurgischen Techniken, Immunsuppression und posttransplantatorischem Management erheblich verbessert. Die Ein-Jahres-Überlebensraten der Patienten erreichen in erfahrenen Zentren 80-90 %. Dennoch stellt die akute zelluläre Abstoßung (ACR) weiterhin eine große Herausforderung für diese Patienten dar.

Derzeit ist der Goldstandard für die Diagnose von ACR die histologische Untersuchung von Biopsieproben, die zum Zeitpunkt der Endoskopie entnommen werden. Einschränkungen umfassen die Tatsache, dass die Endoskopie per Definition invasiv, kostspielig, mit Risiken für Blutungen, Infektionen oder Perforation verbunden und potenziell ungenau ist. ACR kann sich als fleckiger Prozess präsentieren, der bei der endoskopischen Überwachung bis zu 30 % der Zeit übersehen werden kann. Sie präsentiert sich auch ähnlich wie eine Infektion, was zu einem diagnostischen Dilemma hinsichtlich des optimalen Managements des Patienten führt. Solche Verzögerungen und Ungenauigkeiten bei der Diagnose und Behandlung von ITx-Empfängern können zum Verlust von Patienten und Transplantaten führen. Neue nicht-invasive Techniken zur Überwachung von ACR sind eindeutig erforderlich, um das Feld der ITx weiter voranzutreiben.

Die Proteomik ermöglicht die Identifizierung von Proteinen als mögliche Biomarker. Proteinprofile können leicht in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden, was diese Proteinkombinationen zu potenziell innovativen Biomarkern macht, die für die Diagnose oder Krankheitsüberwachung nützlich sind. Die Verfolgung von Protein- und Metabolitenspiegeln könnte sich als genaues Screening-Instrument für Patienten erweisen, bei denen ACR vermutet wird.

In dieser Studie verwenden wir Hochdurchsatz-Proteomanalysen und kandidatenbasierte Immunoassay-Proteindetektion von Stomasekreten, um auf nicht-invasive Weise nach molekularen Profilen von epithelialem Stress und angeborener Immunität während ACR zu suchen.

IMMUNSUPPRESSION:

Alle Patienten werden mit einer Tacrolimus-basierten Dreifach-Immunsuppression behandelt. Unser Standard-Immunsuppressionsregime umfasst die Induktion mit einem Interleukin-2-Rezeptor-Antagonisten wie Daclizumab oder Basiliximab gegenüber Kaninchen-Antithymozyten-Globulin. Die Erhaltungstherapie besteht aus Tacrolimus, Kortikosteroiden und Mycophenolat-Mofetil. Die angestrebten Tacrolimus-Talspiegel liegen bei 10-15 ng/mL. Sirolimus wird als Rettungsmittel und als Teil eines nierenschonenden Regimes eingesetzt. ACR wird durch Histopathologie diagnostiziert und mit hochdosierten Steroiden behandelt. Bei Patienten mit schwerer ACR wird ATG als Rettungsmittel eingesetzt. Bei hoch sensibilisierten Patienten oder Patienten mit Verdacht auf antikörpervermittelte Abstoßung wird eine Kombination aus Plasmapherese, Rituximab und IVIG verwendet.

DARMÜBERWACHUNG:

Protokollbiopsien des transplantierten Darms werden einmal wöchentlich ab dem postoperativen Tag 7-14 für die ersten 3-4 Wochen entnommen, dann alle 2 Wochen bis 8 Wochen nach ITx. Endoskopie und Biopsien werden auch bei klinischen Symptomen durchgeführt, die auf eine abnorme Transplantatfunktion hinweisen. Mehrere gezielte Biopsien werden entnommen, und in Paraffin eingebettete Schnitte, die mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt sind, werden von einem von drei UCLA-Gastrointestinalpathologen nach Standard-Abstoßungskriterien auf ACR bewertet. Abnorme Ergebnisse führen bei Bedarf zu weiterer endoskopischer Überwachung.

STOMASEKRET-SAMMLUNG UND PROTEOMISCHE AUSWERTUNG:

Stomasekrete werden gesammelt, sofort auf Eis gelegt und im UCLA-Hochdurchsatz-Klinische-Proteomik-Massenspektrometrie-Kernlabor batchweise verarbeitet. Alle Proben werden in dreifacher Ausführung unter Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie verarbeitet und analysiert. MALDI-MS-Spektren werden in Textdateien umgewandelt und mit einem etablierten Protokoll vorverarbeitet. Die vorverarbeiteten MALDI-Daten werden dann aus SpecAlign exportiert und weiter in R analysiert.

ENZYMGEKOPPELTER IMMUNOSORBENT-ASSAY UND IMMUNHISTOCHEMIE:

Humanes HNP 1-3 wird in doppelten verarbeiteten Proteinproben mit einem ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Cell Sciences, Canton, MA) quantifiziert, wobei eine HNP1-3-Standardkurve für jede Platte erstellt wird. Die Proteinkonzentrationen werden auch für jede Testprobe bestimmt (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), und die HNP1-3-Spiegel werden auf Gesamtprotein (pg/mg) normalisiert.

Für IHC werden Biopsieschnitte entparaffiniert, durch Standardmethoden für Hintergrund-Peroxidaseaktivität und Bindung von Ziegenantikörpern blockiert und mit humanem Anti-HNP 1-3-Antikörper (Kaninchen, 1:2000) oder vorimmunisiertem Serum (Kaninchen, 1:2000) als Negativkontrolle gefärbt. Die Schnitte werden weiter mit einem biotinylierten Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper und einem Streptavidin-Peroxidase-konjugierten Tertiärantikörper aus dem Vectastain Elite ABC-Kit (Vector Laboratories) gemäß dem Protokoll des Herstellers inkubiert und mit Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB)-Substratlösung (Pierce, Rockford, IL) entwickelt. Für die IHC-Quantifizierung werden 10 Krypten in drei verschiedenen Bereichen auf dem Biopsieschritt auf Hinweise auf signifikante Defensin-Färbung untersucht. Die Anzahl der defensin-positiven Krypten wird gezählt und gemittelt.

LUMINEX:

Ein Aliquot des verarbeiteten Stomasekrets wird für die Luminex-Auswertung verwendet, mit dem Bio-Rad-Human-Cytokine-17-Plex-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad, Hercules, CA). Die Daten werden auf einem Bio-Plex 200-System erfasst und mit der zugehörigen Software (Bio-Rad) analysiert, und die Zytokinkonzentrationen werden auf Proteinkonzentration normalisiert und logarithmisch transformiert.