Proteomanalyse afslører medfødt immunaktivitet i intestinal transplantation dysfunktion

INDLEDNING:

Intestinal transplantation (ITx) tilbyder en potentiel overlevelsesmulighed for patienter med intestinal insufficiens, som har udviklet livstruende komplikationer. Omkring 200 ITx-procedurer udføres årligt på verdensplan, med i alt 2200 sådanne procedurer udført, hvoraf to tredjedele har været på børn. Overordnet set er patient- og graft-overlevelsesraterne blevet forbedret markant over de seneste år på grund af innovationer inden for kirurgiske teknikker, immundæmpning og post-transplantationshåndtering. Etårige patientoverlevelsesrater nærmer sig 80-90% på erfarne centre. Ikke desto mindre udgør akut cellulær afstødning (ACR) fortsat store udfordringer for disse patienter.

I øjeblikket er den gyldne standard for diagnostik af ACR histologisk undersøgelse af biopsiprøver, der indhentes under endoskopi. Begrænsninger inkluderer, at endoskopi per definition er invasivt, kostbart, forbundet med risiko for blødning, infektion eller perforation, og potentielt unøjagtigt. ACR kan præsentere sig som en pletvis proces, som kan blive overset af endoskopisk overvågning op til 30% af tiden. Det præsenterer sig også på lignende måde som infektion, hvilket fører til et diagnostisk dilemma omkring den optimale håndtering af patienten. Sådanne forsinkelser og unøjagtigheder i diagnosen og håndteringen af ITx-modtagere har potentiale til at føre til patient- og grafttab. Nye ikke-invasive teknikker til overvågning for ACR er tydeligvis nødvendige for fortsat at drive feltet for ITx fremad.

Proteomik muliggør identificering af proteiner som mulige biomarkører. Proteinprofiler kan let detekteres i kropsvæsker, hvilket gør disse proteinkombinationer til potentielt innovative biomarkører, der er nyttige i diagnostik eller sygdomsmonitorering. Opfølgning på protein- og metabolitniveauer kan vise sig at være et præcist screeningsværktøj for patienter mistænkt for at have ACR.

I denne undersøgelse bruger vi højgennemløbsproteomanalyse og kandidat-immunoassay-proteindetektion af stomiaffluenter til at søge på en ikke-invasiv måde efter molekylære profiler af epitelstress og medfødt immunitet under ACR.

IMMUNDÆMPNING:

Alle patienter håndteres med tacrolimus-baseret trippel immundæmpning. Vores standard immundæmpningsregime inkluderer induktion med en interleukin-2-receptorantagonist såsom daclizumab eller basiliximab, versus kanin antitymocytglobulin. Vedligeholdelsesterapi består af tacrolimus, kortikosteroider og mycophenolat mofetil. Mål-tacrolimus-trough-niveauer er 10-15 ng/mL. Sirolimus bruges som redningsmiddel og som en del af en nyresparende ordination. ACR diagnostiseres ved histopatologi og behandles med højdosis steroider. Hos patienter med svær ACR bruges ATG som redningsmiddel. Hos højt sensibiliserede patienter eller patienter mistænkt for antistofmedieret afstødning bruges en kombination af plasmaforese, Rituximab og IVIG.

INTESTINAL OVERVÅGNING:

Protokolbiopsier af den transplanted tarm indhentes en gang ugentligt fra postoperativ dag 7-14 i de første 3-4 uger, derefter en gang hver 2. uge indtil 8 uger efter ITx. Endoskopi og biopsier indhentes også for kliniske symptomer, der indikerer unormal allograftfunktion. Flere målrettede biopsier indhentes, og paraffin-indlejrede snit farvet med hematoxylin og eosin (H&E) graderes for ACR ved hjælp af standard afstødningskriterier af en af tre UCLA gastrointestinale patologer. Unormale resultater udløser yderligere endoskopisk overvågning som angivet.

STOMIAFFLUENTINDSAMLING OG PROTEOMISK EVALUERING:

Stomiaffluenter indsamles, straks placeres på is og batchforarbejdes på UCLA High Throughput Clinical Proteomics massespektrometri kernelaboratorium. Alle prøver forarbejdes og analyseres i triplikat ved hjælp af MALDI-massespektrometri. MALDI-MS-spektra konverteres til tekstfiler og forbehandles ved hjælp af en etableret protokol. De forbehandlede MALDI-data eksporteres derefter fra SpecAlign og analyseres yderligere i R.

ENZYMLINKET IMMUNOSORBENT ASSAY OG IMMUNOHISTOKEMI:

Human HNP 1-3 kvantificeres i duplikat forarbejdede proteinprøver ved hjælp af et ELISA-kit efter producentens instruktioner (Cell Sciences, Canton, MA), ved brug af en HNP1-3-standardkurve konstrueret for hver plade. Proteinkoncentrationer bestemmes også for hver testprøve (BCA, Pierce Thermo Scientific, Rockford, IL), og HNP1-3-niveauer normaliseres til totalprotein (pg/mg).

For IHC deparaffineres biopsisnit, blokeres for baggrundsperoxidaseaktivitet og ged-antistofbinding ved standardmetoder, og farves med human anti-HNP 1-3-antistof (kanin, 1:2000) eller pre-immuniseret serum (kanin, 1:2000) som negativ kontrol. Snittene inkuberes yderligere med et anti-Kanin IgG biotinyleret sekundært antistof og streptavidin-peroxidase konjugeret tertiært antistof fra Vectastain Elite ABC-kittet (Vector Laboratories) i henhold til producentens protokol og udvikles med diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) substratopløsning (Pierce, Rockford, IL). For IHC-kvantificering evalueres 10 krypt i tre forskellige felter på biopsigliden for evidens for signifikant defensinfarvning. Antallet af defensin-positive krypt tælles og middles.

LUMINEX:

En portion af forarbejdet stomiaffluent bruges til Luminex-evaluering med Bio-Rad human cytokin 17-plex assay efter producentens instruktioner (Bio-Rad, Hercules, CA). Data indhentes på et Bio-Plex 200-system og analyseres med tilhørende software (Bio-Rad), og cytokinkoncentrationer normaliseres til proteinkoncentration og log-transformeres.